保元汤对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用及机制研究

张训乐 王姗姗 赵佳惠 黄家情 闻 妩 贡岳松

(南京中医药大学2016级硕士研究生，江苏 南京 210046)

保元汤最早见于明·魏直的《博爱心鉴》，是治疗元气虚弱的著名方剂，组方包含黄芪、人参、甘草、肉桂4味药，全方可大补元气，尤补后天脾、肺之气，健脾保肺温肾，能治一切元气虚弱之症，故名保元汤，并通过历代医家的临床运用，验证了其确切的临床效果[1-2]。随着现代研究的不断深入，保元汤的临床应用也日益广泛，相关研究表明保元汤在免疫系统、血液系统、心血管系统及抗氧化等方面有较好的作用[3-5]。我们基于这些研究推测，保元汤具有一定的抗衰老作用。线虫是广泛应用于遗传学、发育生物学、细胞生物学等领域的模式生物，用于揭示先天免疫、氧化胁迫效应、环境暴露与损伤的机制，其中秀丽隐杆线虫具有生活周期短、易饲养、生物学终点多、在实验室可大量培养等特点，已成为衰老研究中常用的模式生物，并拥有与哺乳动物同源的抗氧化胁迫机制和相关基因[6-7]。因此，我们尝试利用秀丽隐杆线虫作为模型，观察保元汤提取物对秀丽隐杆线虫寿命的延长作用，探讨保元汤可能的抗衰老作用及机制。

1 材料与方法

1.1 虫株与菌株 野生型N2秀丽隐杆线虫，采用线虫生长培养基(NGM)，以大肠杆菌Escherichia coli OP50 饲喂，由美国宾夕法尼亚大学提供。

1.2 实验药物及试剂

1.2.1 实验药物 保元汤药物组成：黄芪、人参、甘草、肉桂，比例6∶2∶2∶1(北京同仁堂南京药店有限公司)。

1.2.2 实验试剂 NGM培养基配方：氯化钠(NaCl)3 g，蛋白胨2.5 g，琼脂17 g，磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液(1 mol/L，pH 6.0)25 mL，双蒸水(ddH2O)975 mL，灭菌处理后加胆固醇溶液(5 mg/mL)1 mL，硫酸镁溶液(MgSO4)(1 mol/L)1 mL，氯化钙溶液(CaCl2)(1 mol/L)1 mL。S-培养基配方：K2HPO4-KH2PO4缓冲液(1 mol/L，pH 6.0)50 mL，NaCl 5.9 g，加水定容至1 L，灭菌处理后加胆固醇溶液(5 mg/mL)1 mL，混匀后量取977 mL混合液，加1M柠檬酸钾缓冲液(pH 6.0)10 mL，痕量金属溶液10 mL，MgSO4(1 mol/L)3 mL，CaCl2(1 mol/L)3 mL。线虫M9缓冲液：KH2PO43 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4) 6 g，NaCl 5 g，1 ml MgSO4，加 ddH2O至1 L，121℃灭菌。

1.3 实验仪器 超净工作台(苏净安泰空气技术有限公司)；显微镜(日本Olympus公司)；高压灭菌锅[致微(厦门)仪器有限公司]；生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；离心机、旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 药物提取 依据保元汤方药物比例称取药材30 g，研成粉末，加10倍量水采用回流提取法提取1 h，提取3次，合并3次药液，旋转蒸发仪蒸发至100 mL，最后采用真空冷冻干燥法获得保元汤粗提物。

1.4.2 线虫培养 于空白的NGM培养基中央滴入50 μL左右的大肠杆菌菌液，用涂布器将菌液均匀涂布，注意菌液边缘不宜太过，应距离平板边缘5 mm左右，采用团块法将秀丽隐杆线虫接种在含大肠杆菌的NGM培养基上，20 °C培养箱中恒温培养[8]。

1.4.3 同步化处理 用液体NGM冲下培养基中的L4期秀丽隐杆线虫成虫，转至10 mL无菌离心管中，高心机1300×g离心1 min,洗涤2次，保留与约0.25 mLNGM,加无菌水3.75 mL,加碱裂解液[氢氧化钠(NaOH)(5 mol/L)0.5 mL，漂白剂(Bleach)1 mL]至混匀振荡，每2 min至于显微镜下观察秀丽隐杆线虫线虫裂解状态，裂解时间不超过6 min。1300×g离心1 min，液体NGM洗涤2次，S-培养基洗涤2次，移除上清，加S-培养基8 mL，置于20 ℃培养箱中振摇孵育24 h，从而得到生长同期化的秀丽隐杆线虫[9]。

1.4.4 实验分组 将同期化的秀丽隐杆线虫分为空白对照组、溶剂对照组、保元汤组，空白组对照组不加任何药物，溶剂对照组加二甲基亚矾溶剂，保元汤组分别加1000、500、200、100、50 μg/mL的保元汤提取物药液培养，条件20 ℃恒温，选用96孔板液体培养法进行给药干预培养。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 寿命实验[10-11]比较各组秀丽隐杆线虫的寿命变化情况，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预，每组100条左右，给药当日年龄标记为0。每日显微镜观察秀丽隐杆线虫的状态，记录存活、死亡数量，计算平均寿命。观测前将96孔板置于摇床上轻轻振摇2 min，秀丽隐杆线虫死亡判定标准为振动或强光刺激秀丽隐杆线虫不弯曲身体或头部不摆动，身体呈僵直状态。

1.5.2 生殖力测定[12-13]比较各组秀丽隐杆线虫的生殖力变化情况，采用同期化的L1期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L1期后，各组进行给药干预。药物干预48 h后，用移液器吸取秀丽隐杆线虫，转至标注好的1.5 mL离心管中，1300×g离心1 min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1 min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板1条，每组15条，转移至20 ℃培养箱中培养24 h，显微镜下观察统计每块培养皿上的虫卵数目。

1.5.3 运动能力测定[14-15]比较各组秀丽隐杆线虫的运动能力变化情况，正常情况下其以S形向前移动，衰老后运动能力下降，运动弯曲的频率减少，可反映其生命活力，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物干预6 d后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5 mL离心管中，1300×g离心1 min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1 min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，每组15条，让其自由运动1 min，显微镜下统计秀丽隐杆线虫1 min内运动S形的个数(即1 min内走过的峰数)，重复3次。

1.5.4 头部摆动测定[16-17]比较各组秀丽隐杆线虫的头部摆动变化情况，头部摆动行为定义为头部摆动方向改变且改变角度大于90°，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物干预6 d后，用移液器吸取线虫，转至标注好的1.5 mL离心管中，1300×g离心1 min。移除上清，加线虫M9缓冲液，1300×g离心1 min，重复2次。移液器吸取秀丽隐杆线虫至空白NGM培养皿上，每板5条，每组15条，让其自由运动1 min后，观察记录其在1 min 内头部摆动次数。

1.5.5 热应激[18-19]比较各组秀丽隐杆线虫的热应激能力变化情况，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。药物处理2 d后，每组15条，去除封口膜，将96孔板上秀丽隐杆线虫一起转移到35 ℃培养箱中热应激10 h，然后再将其转移到20 ℃培养箱中继续培养，每日显微镜下观察记录秀丽隐杆线虫死亡、存活条数，直至空白对照组秀丽隐杆线虫存活率<10%。存活率(%)=(总数-死亡数目)/总数×100%。

1.5.6 氧化应激[13,18]比较各组秀丽隐杆线虫的氧化应激能力变化情况，采用同期化的L4期秀丽隐杆线虫观察。同步化处理的秀丽隐杆线虫由卵成长至L4期后，各组进行给药干预。。药物处理2 d后，每组15条，各组分别加入20 mmol/L百草枯，进行氧化应激处理，培养24 d后，开始每日显微镜下观察统计秀丽隐杆线虫死亡、存活条数，直至空白对照组秀丽隐杆线虫存活率<10%。

2 结果

2.1 各组秀丽隐杆线虫寿命情况比较 见表1。

表1 各组秀丽隐杆线虫寿命情况比较

由表1可见，溶剂对照组秀丽隐杆线虫平均寿命与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。保元汤各组中100 、200、500 μg/mL组秀丽隐杆线虫平均寿命较空白对照组均明显延长，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；50、1000 μg/mL组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组秀丽隐杆线虫生殖力情况比较 见表2。

表2 各组秀丽隐杆线虫生殖力情况比较

由表2可见，溶剂对照组及保元汤各组秀丽隐杆线虫平均产卵量与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，保元汤各组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组秀丽隐杆线虫运动能力情况比较 见表3。

表3 各组秀丽隐杆线虫运动能力情况比较

由表3可见，溶剂对照组秀丽隐杆线虫1 min平均运动峰数与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。保元汤各组中200、500、1000 μg/mL组秀丽隐杆线虫1 min平均运动峰数较空白对照组均明显增多，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；50、100 μg/mL组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组秀丽隐杆线虫头部摆动情况比较 见表4。

表4 各组秀丽隐杆线虫头部摆动情况比较 次，

由表4可见，溶剂对照组秀丽隐杆线虫1 min平均摆动次数与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。保元汤各组中200、500、1000 μg/mL组秀丽隐杆线虫1 min平均摆动次数较空白对照组均明显增多，比较差异均有统计学意义(P<0.05)，但3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；50、100 μg/mL组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 各组秀丽隐杆线虫热应激测试比较 热应激测试后的第1、2天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫均出现明显死亡，而保元汤各组可以显著提高秀丽隐杆线虫的耐热能力，其中200、500、1000 μg/mL组存活率均明显高于空白对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。热应激测试第3天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫几乎全部死亡，而保元汤各组还有约10%以上存活率，其中200、500、1000 μg/mL组存活率明显高于空白对照组(P<0.05)。见图1。

图1 各组秀丽隐杆线虫热应激测试比较(*P<0.05)

2.6 各组秀丽隐杆线虫氧化应激测试比较 氧化应激测试第1、2、3天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫均出现明显死亡，而保元汤各组可以显著提高秀丽隐杆线虫的抗氧化应激损伤的能力，其中200、500、1000 μg/mL组存活率均明显高于空白对照组。氧化应激测试第4天空白对照组和溶剂对照组秀丽隐杆线虫几乎全部死亡，而保元汤各组还有约10%以上的存活率，其中200、500、1000 μg/mL组存活率明显高于空白对照组(P<0.05)。见图2。

图2 各组秀丽隐杆线虫氧化应激测试比较(*P<0.05)

3 讨论

中医学对衰老的认识和研究源远流长，早在《内经》中就有“”正气存内，邪不可干”的论述，认为气是构成人体和维持人体生命活动的基本物质，机体正气充足，则抵御外邪能力强，从而身强体健不易发病而可得“天年”，气虚、气不足可导致机体的脏腑功能减退，加速衰老[20-21]。中医学历经几千年的临床实践，在如何延年益寿和抗衰老方面积累了丰富的用药经验，其中保元汤作为补气剂的代表方，经历代医家的临床运用验证，疗效确切，可益气补虚培元，主治虚损劳怯、元气不足、倦怠乏力等[22-23]。方中人参性禀中和，益元气而生精血，善补脾肺之气；黄芪则侧重补益卫表之气，固腠理而补元气，与人参相须为用，增强补气之功；肉桂鼓舞命门真气，鼓动气血运行，可助心阳和温化水饮；甘草益气和中，调和诸药。四药合用，补元气，生精血，阴阳兼顾，彻里彻外，通补无泻，而奏气足、精充、神旺的功效。现代药理研究证实，保元汤在免疫系统、血液系统、心血管系统及抗氧化作用等方面均有较好的药理作用[24-25]。

衰老是指生物体在正常状况下发育成熟后，随着年龄的继续增加，机体的生理功能出现逐渐下降的表现，最终导致生命体死亡的过程，因此在延缓衰老的研究中寿命的长短可作为其一个定量指标[26]。本实验结果显示，保元汤在100 、200、500 μg/mL剂量时可明显延长秀丽隐杆线虫的寿命，表明保元汤对秀丽隐杆线虫而言有延缓衰老的作用。

在衰老领域，长寿和生殖总是被联系在一起，且普遍认为寿命与其生殖能力成反比关系，对大多数生物体而言，当生殖期结束则机体就逐渐开始呈现衰老。有研究认为，包括线虫、黑腹果蝇、人类等有机体都有通过干预生殖功能来实现延长寿命的可能性，但目前这个观点还有颇多争议[27]。本实验结果显示，保元汤在延缓秀丽隐杆线虫衰老的同时并没有影响其产卵量，说明保元汤对秀丽隐杆线虫并没有生殖毒性，也不是通过抑制生殖来延长寿命。

运动能力可反映秀丽隐杆线虫的生命活力，秀丽隐杆线虫在运动过程中以正弦曲线S的形式向前移动，当秀丽隐杆线虫出现衰老时其运动能力也会明显下降，因此我们通过观察秀丽隐杆线虫运动来辅助证明药物延缓衰老的作用。同时秀丽隐杆线虫头部摆动能力在一定程度上反映秀丽隐杆线虫的衰老，其头部摆动与身体肌壁组织、摄食行为有一定的关系，摆动次数越多说明，说明其生命活力越强。本实验结果显示，保元汤在200、500、1000 μg/mL剂量时能提高秀丽隐杆线虫的活动能力，增加头部摆动次数，这些可能是抑制了衰老过程中神经系统和肌肉的退化，延长秀丽隐杆线虫寿命的同时提高生命活力。

有研究表明，压力应激抵抗能力的提高与生物体寿命延长有关[18]，几乎所有已知的长寿突变体线虫在热应激、氧化应激、重金属毒性、紫外线放射的压力下，都显示出了更强的抵抗外界环境压力的能力。因此，压力应激实验的结果可作为检测药物延寿作用的常规指标之一。本实验结果显示，各组用百草枯制作氧化应激损伤，而保元汤在200、500、1000 μg/mL剂量时可明显提高秀丽隐杆线虫抗氧化应激能力，提高存活率。除了氧化应激外，热应激也是衰老研究中常用的实验指标之一，在相关线虫长寿突变株的研究中发现，提高热激转录因子1(HSF-1)表达，也能延长线虫的寿命和提高应激抗性[28-29]。本实验结果显示，在热应激条件下，保元汤在200、500、1000 μg/mL剂量时表现出了明显的抗热应激能力。这一结果预示保元汤抗线虫衰老的作用可能与提高HSF-1有关，其相互关系有待进一步研究。

综上所述，保元汤能够有效延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，而不影响其生殖功能，具有延缓衰老的作用，其机制可能与提高秀丽隐杆线虫抗应激能力有关。然而有关保元汤更多的抗衰老作用机制有待将来进一步研究。