当归四逆加吴茱萸生姜汤对不孕症模型大鼠高迁移率族蛋白B1、自噬蛋白Beclin-1、免疫球蛋白G及炎症因子的影响※

丁凯雯 颜培正 张 敏

[山东第一医科大学第一附属医院(山东省千佛山医院)产科，山东 济南 250014]

近年来，不孕症发病率呈现出不断上升趋势，但其发病原因仍不明确。有研究认为[1-2]，不孕症的发生可能与体内炎症因子变化及免疫学因素相关。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)属于非组蛋白，其含量丰富且高度保守。近年来研究显示，HMGB1可调节炎性反应过程，通过调控细胞内多种免疫因子的变化影响不孕症的发展[3-4]。本实验通过观察当归四逆加吴茱萸生姜汤对不孕症模型大鼠免疫HMGB1及自噬蛋白Beclin-1的表达及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、干扰素γ(IFN-γ)、免疫球蛋白G(IgG)的调控作用，探讨当归四逆加吴茱萸生姜汤治疗不孕症的基本机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雌性Wistar大鼠60只，3月龄，体质量(180±20)g，由济南大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(鲁)2019-0001。自由进食、饮水，室温(23±2)℃，相对湿度60%。

1.2 实验药物及试剂 当归四逆加吴茱萸生姜汤药物组成：当归45 g，桂枝45 g，白芍45 g，细辛25 g，通草30 g，吴茱萸140 g，生姜125 g，大枣25枚，炙甘草30 g。置于凉水中浸泡2 h，蒸煮30 min后浓缩至浓度为0.5 g/mL的药液。丙酸睾酮注射液(天津金耀药业有限公司，国药准字H12020532)；枸橼酸氯米芬片(Medochemie Ltd.，进口药品注册证号H20140688)；TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(批号：K1052-100)、IL-1 ELISA检测试剂盒(批号：BEK-2309-1P)、IFN-γELISA检测试剂盒(批号：BEK-2119-1P)、IgGELISA检测试剂盒(批号：BEK-2104-2P)，均购自武汉艾美捷科技公司；兔抗大鼠HMGB1抗体(批号：H00003141-M)、兔抗大鼠自噬蛋白Beclin-1抗体(批号：R-141-100)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(批号：A470012)，均购自北京博尔西科技有限公司；20%乌拉坦溶液(3 mL/kg)(国药集团化学试剂有限公司)；4%多聚甲醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 将60只Wistar大鼠按照随机数字表法分为4组，空白组、模型组、枸橼酸氯米芬片组、当归四逆加吴茱萸生姜汤组，每组各15只。

1.3.2 造模 除空白组大鼠外，其余3组大鼠均参照文献[5-6]制备不孕症大鼠模型：大鼠颈背部皮下注射丙酸睾酮注射液0.2 mL，隔日1次，连续注射7 d。末次注射后,用无菌棉签擦取大鼠阴道脱落细胞，观察是否出现角化上皮细胞，持续出现5 d即提示不孕症大鼠造模成功，剔除造模失败大鼠。

1.3.3 给药治疗 造模结束后第2天开始灌胃给药，枸橼酸氯米芬片组予枸橼酸氯米芬片溶液治疗，按人鼠比例换算制备成0.83 mg/mL溶液，按照0.83 mg/100 g灌胃治疗，每次2 mL,每日1次。当归四逆加吴茱萸生姜汤组予当归四逆加吴茱萸生姜汤浓缩药液灌胃，浓度0.5 g/mL，每次2 mL，每日2次。空白组、模型组予0.9%氯化钠注射液，每次2 mL，每日1次灌胃。各组大鼠均连续灌胃治疗15 d。

1.4 标本采集及检测

1.4.1 大鼠子宫组织观察 末次给药24 h后，予20%乌拉坦溶液7.5 mL/kg麻醉并处死大鼠，取血后剖取各组大鼠子宫，4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，200倍显微镜下观察大鼠子宫组织形态学变化，Digimizer(医学图像分析软件)4.5.2测量子宫内膜厚度。

1.4.2 大鼠血清IgG及炎症因子测定 处死大鼠后，取大鼠静脉血10 mL置于离心机中做离心处理，离心半径10 cm，转速3000 r/min，离心10 min，取上清液，ELISA法检测并记录各组大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG含量。

1.4.3 HMGB1及自噬蛋白Beclin-1蛋白表达测定 应用免疫印迹法(Western Blot)检测。大鼠处死后，取大鼠子宫内膜组织0.5 cm×0.5 cm，将子宫内膜组织按照每10 mg组织加入裂解液250 μL，冰上放置10 min，样品裂解后，13 000 r/min，离心10 min，取上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。配制分离胶和浓缩胶，确定上样量后凝胶电泳后转至PVDF膜。加入兔抗大鼠HMGB1抗体、兔抗大鼠自噬蛋白Beclin-1抗体一抗在4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后加入含辣根过氧化物酶缀合的羊抗兔抗体二抗室温孵育1 h。洗膜后浸泡于ECL显色液中进行曝光、显影并定影。Quantity One软件分析各组大鼠HMGB1及自噬蛋白Beclin-1蛋白灰度值表达水平，用目标蛋白与对应的内参(β-Actin)的比值，得出目标蛋白的表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫组织形态变化 空白组大鼠子宫组织细胞排列整齐，厚度均匀，间质正常，无(少)炎性浸润；模型组大鼠子宫组织间质水肿疏松，腺体稀少，细胞排列错乱；枸橼酸氯米芬片组大鼠炎症细胞减少，细胞水肿减少；当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠炎症细胞减少，细胞排列整齐。见图1。

图1 各组大鼠子宫组织形态变化(HE，×200)

2.2 各组大鼠子宫内膜厚度比较 见表1。

表1 各组大鼠子宫内膜厚度比较

由表1可见，模型组大鼠子宫内膜厚度低于空白组(P<0.05)；枸橼酸氯米芬片组、当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠子宫内膜厚度均高于模型组(P<0.05)；当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠子宫内膜厚度高于枸橼酸氯米芬片组(P<0.05)。

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量比较 见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量比较

由表2可见，模型组大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量均高于空白组(P<0.05)，枸橼酸氯米芬片组、当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量均低于模型组(P<0.05)，当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠TNF-α、IL-1、IFN-γ及IgG含量低于枸橼酸氯米芬片组(P<0.05)。

2.4 各组大鼠子宫内膜组织中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达比较 见表3。

表3 各组大鼠子宫内膜组织中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达比较

由表3可见，模型组大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达高于空白组(P<0.05)，枸橼酸氯米芬片组、当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达均低于模型组(P<0.05)，当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达低于枸橼酸氯米芬片组(P<0.05)。各组大鼠子宫内膜组织中HMGB1 、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达见图2。

A空白组；B模型组；C枸橼酸氯米芬片组；D当归四逆加吴茱萸生姜汤组

3 讨论

不孕症发病机制复杂，除排卵障碍、精液异常、输卵管异常外，炎性反应、免疫抑制因素也能导致不孕发生[7-8]。有研究认为，免疫抗体的阳性表达增强，对于免疫性不孕症有重要影响[9]。不孕症发生时，组织内炎性因子的种类和比例发生变化，机体在免疫作用机制下出现免疫异常表达[10]。临床中炎症因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG在免疫性不孕症患者中普遍呈现升高状态，且对疾病的发展转归呈现一定程度的表达变化。TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG等能通过调控多种细胞信号通路来释放多种免疫抗体，从而达到干预组织炎性反应的效果，是机体进行特异性反应的重要因子[11-12]。HMGB1是一种高度保守的核蛋白，具有十分强大的TATA盒(真核生物启动子的元件之一)启动子，可对基因转录的选择发挥重要作用，进一步影响细胞核内的转录、复制、重组和基因组稳定性[13]。HMGB1除核功能外，还可作为细胞外信号分子调节免疫反应、炎症、自噬过程[14]。组织内发生炎性反应时，巨噬细胞在炎症因子刺激下能够释放大量HMGB1，而HMGB1又负反馈通过靶向抑制因子表达来调控炎症因子释放，减弱免疫因素诱导的不孕症过程[15]。自噬蛋白Beclin-1在体内能特异性调节组织中自由基活动程度，对机体的炎性反应和炎症过程发挥重要作用[16]。自噬蛋白Beclin-1蛋白在胞内能与HMGB1蛋白特异性结合阻断多种炎性因子表达，进而抑制炎性反应过程[17-18]。

中医学认为，素体血虚、内有久寒是导致不孕症发生的重要原因。《傅青主女科》谓 “寒冰之地， 不生草木；重阴之渊，不长鱼龙。今胞胎既寒，何能受孕”[19]。《滇南本草》亦指出“治妇人经行受寒， 月经不调……不能受胎”。因此，治疗不孕症应以养血通络、散寒降逆为主。当归四逆加吴茱萸生姜汤出自张仲景《伤寒论》，由当归四逆汤合吴茱萸、生姜组成。方中当归补血活血，桂枝温经散寒通脉，2味为君药；白芍助当归和营补血，以治血虚，细辛、通草助阳散寒，3味为臣药；吴茱萸、生姜温中散寒，降逆和胃，助君臣活血散寒之力，共为佐药；大枣、炙甘草益气健脾养血，调和药性，共为使药。全方共奏养血通络、散寒降逆功效。

本研究结果显示，空白组大鼠子宫组织细胞排列整齐，厚度均匀，间质正常，无(少)炎性浸润；模型组大鼠子宫组织间质水肿疏松，腺体稀少，细胞排列错乱；经药物治疗后，枸橼酸氯米芬片组大鼠炎症细胞减少，细胞水肿减少；当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠炎症细胞减少，细胞排列整齐，提示当归四逆加吴茱萸生姜汤对不孕症大鼠，子宫组织形态学具有明显改善作用。模型组大鼠子宫内膜厚度低于空白组(P<0.05)，枸橼酸氯米芬片组、当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠子宫内膜厚度均高于模型组(P<0.05)，当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠子宫内膜厚度高于枸橼酸氯米芬片组(P<0.05)，进一步证实当归四逆加吴茱萸生姜汤通过增加大鼠子宫内膜厚度，提高受孕率。

本研究结果显示，不孕症大鼠造模成功后，大鼠子宫内膜组织炎性变化明显，炎症因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG含量明显升高(P<0.05)。枸橼酸氯米芬组和当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠治疗后TNF-α、IL-1、IFN-γ、IgG含量均降低(P<0.05)，其中当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠治疗效果优于枸橼酸氯米芬片组(P<0.05)，说明当归四逆加吴茱萸生姜汤可能通过调控不孕症大鼠的免疫应答改变，从而在机体内产生抗炎抑炎作用。本研究结果还发现，造模后大鼠子宫内膜组织中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达显著升高(P<0.05)，说明HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白在造模后表达出现增强趋势，这也证实HMGB1、自噬蛋白Beclin-1及其调节机制可能与不孕症的发病具有一定的相关性。进一步研究发现，枸橼酸氯米芬组、当归四逆加吴茱萸生姜汤组大鼠治疗后子宫内膜组织中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达水平下降(P<0.05)，且当归四逆加吴茱萸生姜汤组下降更明显(P<0.05)，这也说明当归四逆加吴茱萸生姜汤可有效降低不孕症模型大鼠子宫内膜组织中HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达，进一步调控自由基释放，从而抑制炎性反应进程。

综上所述，当归四逆加吴茱萸生姜汤可通过调控HMGB1、自噬蛋白Beclin-1蛋白表达，抑制炎症因子TNF-α、IL-1、IFN-γ及免疫因子IgG反应，进而控制不孕症大鼠炎性反应过程。