荧光染色镜检法与KOH湿片镜检法在皮肤浅部真菌感染诊断中的应用

赵 野，姜日花，朱明姬,盖保东，王 珂

(吉林大学中日联谊医院 1.皮肤科;2.胃肠结直肠肛门外科;3.产科，吉林 长春130033)

浅部真菌病是一种皮肤科常见病，近年来，随着肿瘤、艾滋病等免疫功能受损患者的增多，以及抗菌类药物滥用，真菌感染发病率呈上升趋势。侵袭性真菌感染(IFD)是感染性疾病死亡的主要原因之一[1-2]。目前临床诊断中真菌感染最常用检查办法是真菌镜检及真菌培养，KOH湿片法是门诊真菌镜检常用的方法，真菌培养法也是公认的诊断真菌病的金标准，但这两种检查方法均易被标本、检查技师水平等因素干扰，导致两者的假阳性及假阴性增加，两种检查方法准确率甚至可低至15%[3]。

近年来出现了荧光染色法检查真菌感染疾病，在肺曲菌病的既往研究中体现了荧光染色法的快捷、敏感、准确性高等优点[4-5]。其机理是由于荧光染色剂特异性结合真菌细胞壁的几丁质，标记真菌菌体，在荧光显微镜下可以观察到真菌菌丝和孢子呈亮蓝色或亮绿色的荧光，结构清晰，可轻易与背景和杂质相鉴别。现将吉林大学中日联谊医院门诊疑诊浅部真菌感染的患者作为研究对象，以期探讨在浅部真菌感染诊断中荧光染色法的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2020年1月-2020年6月期间吉林大学中日联谊医院皮肤科门诊就诊患者中疑诊为浅部真菌感染的450例患者，其中手足癣198例、体股癣167例、甲癣54例、头癣31例;在病损部位采集皮屑、甲屑、断发、发根等作为检验标本。选取的所有患者均未接受抗真菌治疗。

1.2 试剂与仪器

试剂与仪器：荧光染色液(江苏莱芙时代生物有限公司)；10% KOH溶液(自行配置)；奥林巴斯BX41荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.3 方法

1.3.1取材 所有皮损部位均先应用75%乙醇消毒，然后应用一次性手术刀刮取疑诊部位的皮屑、甲屑、断发标本，将取材标本均分为两等份，分别进行荧光染色体以及KOH湿片镜检。以上操作均由2名医师完成，结果一致记录为检验合格。

1.3.2KOH湿片镜检法 取适量取材样本置于载玻片上，加1滴10%KOH溶液，覆盖盖玻片。将载玻片在酒精灯火焰上快速通过2-3次进行加热，避免溶液沸腾造成结晶形成，之后轻压盖玻片，挤压标本，排出气泡，在显微镜下进行镜检。

1.3.3荧光染色法 载玻片上取适量样本后加入1滴荧光染色液，覆盖并轻压盖玻片，排出气泡，在显微镜下进行镜检。

1.4 统计学分析本组研究采用SPSS 22.0软件进行数据分析和处理，其中，计数资料以例(率)形式表示，采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镜下表现

KOH湿片法在显微镜下背景杂乱，真菌菌丝及孢子与背景差异较小，无明显颜色区别，不易辨别；荧光染色法镜下观察背景及杂质呈暗黑色，而真菌孢子及菌丝呈亮蓝色，真菌轮廓清晰与周围环境差异明显，容易辨别。

2.2 疑诊浅部真菌感染应用两种镜检法的阳性率比较

荧光染色法与KOH湿片法阳性率比较两种方法的总阳性率分别为276例(61.33%)、193例(42.89%)，差异有统计学意义(χ2=30.67，P<0.05)。见表1。

表1 两种方法在各种浅部真菌病镜检结果比较

3 讨论

浅部真菌病是一种常见的感染性皮肤病，多因真菌侵犯人体体表组织如皮肤、指(趾)甲、毛发等所致，根据发病部位不同可分为体股癣、手足癣、甲癣、头癣等各类癣病，皮肤癣菌、马拉色菌、念珠菌等是引发该病常见的真菌[6]。

KOH湿片法是目前国内最常用的真菌镜检方法，也是真菌感染性皮肤病与其他疾病鉴别的重要手段之一，也是因其操作简便，成本低廉，已在临床检验中普遍应用[7-8]。但KOH湿片镜检法也有不足之处：背景环境杂乱，标本未经染色，真菌与样本颜色一致，因为细胞壁、纤维及小气泡、脂滴的存在导致难以凸显真菌菌丝及孢子结构，如患者既往不规律涂抹药物、样本中菌丝或孢子量较低时，极易造成漏检，往往需要经验丰富的检验技师，才能提高直接镜检的准确率。

荧光染色法采用酶联染色法，染色液主要成分包括高纯度的荧光素和特定比例的KOH溶液，荧光素标记的几丁质酶能快速识别并特异性的结合真菌细胞壁中的几丁质，形成强荧光复合物，在紫外光作用下，使真菌结构呈亮蓝色荧光，荧光染色剂并不标记脂滴，故脂滴与孢子容易分辨。真菌标本中的纤维素也可被荧光染色法标记，在荧光显微镜下也可发出亮蓝色荧光，但纤维素并没有真菌典型的菌丝横隔和出芽现象，可明确辨别，减少了假阳性结果[9-12]。镜下菌丝形态结构清楚易辨，清晰，反差大，孢子 染 色 后 结 构 清 晰，易 于 分辨，大大提高真菌检出阳性率，且显著缩短真菌镜检时间。荧光染色法容易掌握，滴加染液后无需加热，角质溶解快于KOH湿片法，镜下背景干净，真菌形态清晰显著，易于观察，降低了疑难标本(如菌丝量少、角质过厚、仅有孢子、或外涂药膏)直接镜检的假阳性率，提高准确率，其缺点主要在于试剂成本略高。

本研究将门诊收集的450例疑诊浅部真菌感染患者的标本分别进行荧光染色法和KOH湿片法精简检查，通过比较两者的检出阳性率，结果表明荧光染色法的检出阳性率(61.33%)明显高于KOH湿片法(42.89%)；且不同来源的标本(皮屑、甲屑、毛发)采用荧光染色法检出阳性率也高于KOH湿片法。

综上所述，荧光染色法和KOH湿片法两种方法对于皮肤浅表真菌感染的诊断均有积极意义，具有操作简单的特性；但荧光染色法的检出阳性率更高，为临床疑诊真菌感染患者提供更加快捷、准确的检查方法，在直接镜检的临床应用中具有更好的推广价值。