基于“药物-靶点-通路”网络的血必净注射液治疗COVID-19作用机制研究

杨冬梅,霍艳杰,陈临江,曾 阳,袁志鹰,庹勤慧,赵洪庆

(湖南中医药大学,湖南 长沙410208)

由2019新型冠状病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCo V)引发的新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)在全球范围内流行,严重威胁人们身体健康[1]。新型冠状病毒肺炎的临床分型根据病情危重程度主要为轻型、普通型、重型与危重型[2]。研究发现,在COVID-19重症及危重症患者血浆中中性粒细胞数量增加,淋巴细胞数量显著降低,而多种促炎因子表达水平明显上升[3-5]。其中,危重型患者免疫系统已经完全紊乱,因炎性因子大量产生而出现细胞因子风暴[6-7]。而细胞因子风暴发生迅速,是新型冠状肺炎重型患者发展为危重型患者的主要原因。

血必净注射液作为国家中药二类新药,于非典时期上市,主要应用于脓毒血症、多脏器功能衰竭综合征、肺心病急性加重期、急性肺损伤与急性呼吸窘迫综合征、急性胰腺炎等疾病的治疗[8-11]。2020年4月12日,经国家药品监督管理局批准,血必净新增适应证:“可用于新型冠状病毒肺炎重型、危重型的全身炎症反应综合征或/和多脏器功能衰竭”[12]。本研究拟采用网络药理学方法分析血必净注射液活性成分通过调节免疫与炎症反应治疗COVID-19的作用机制,为其临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

数据库:中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php);Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/);STRING数据库(https://string-db.org/)TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/);DisGeNT数据库(https://www.disgenet.org/);DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。

软件:可 视 化cytoscape3.5.1软 件、pymol软 件 与Autodock4.2分子对接软件,易汉博作图软件(http://www.ehbio.com/ImageGP/index)。

1.2 药物活性成分收集与筛选

利用TCMSP收集血必净注射液:丹参、赤芍、红花、川芎、当归五味中药的主要化学成分。根据人体对药物吸收、分布、代谢及排泄/毒性的药动学参数,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug likeness,DL)≥0.18为筛选条件,初步筛选出血必净注射液潜在具有较高活性的化合物。

1.3 血必净注射液作用靶点的预测

基于筛选的活性成分预测化合物的作用靶点,经Drug-Bank数据库将化合物分子结构与测出的靶点,经Uniprot数据库转化为基因简称命名。

1.4 筛选血必净注射液关键活性成分

将血必净注射液潜在具有较高活性的化合物与成分导入cytoscape 3.5.1软件进行可视化,通过Network Analyzer功能对网络节点中心性进行分析,设置节点度(degree)值大于所有节点连接度2倍中位数为标准进行筛选,确定关键节点。

1.5 COVID-19相关靶点构建

本研究基于TTD、DisGeNT数据库构建COVID-19免疫与炎症相关靶点。利用在线韦恩图工具,将COVID-19基因靶点与血必净注射液活性成分靶点进行映射。

1.6 蛋白质相互作用网络构建

将COVID-19基因靶点与血必净注射液活性成分靶点进行映射结果导入STRING数据库限定物种为Homo sapiens,设定最低要求互动分数为中度信度0.400得到蛋白相互作用(PPI)相关信息。导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化,并利用Network analyzer功能对PPI网络图进行拓扑分析,根据大于平均Degree值对共有靶点进行筛选分析。

1.7 GO富集分析与KEGG通路分析

筛选出关键作用蛋白导入DAVID数据库,设定“Background”为“Homo sapiens”,P<0.05,分别导出细胞组分(CC)、分子功能(MF)、生物过程(BP)进行GO分析。根基P<0.05,KEGG富集分析,筛选免疫与炎症反应相关通路。

1.8 成分-靶点分子对接

从PDB数据库下载SARS-Co V-2 3CL水解酶的3D结构pdb格式文件,移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子,保存为pdb后缀的文件。从PubChem数据库下载化合物2D结构的sdf格式文件。利用pymol软件先上传去水加氢后的蛋白质文件,将其转化为pdbqt格式文件,采用Auto Dock4.2进行分子对接,选取结合能<-5 kJ∙mol-1且构象较好的结果作为分子对接结果。

2 结果

2.1 血必净注射液活性成分收集与筛选

血必净注射液中丹参65个活性成分、赤芍29个活性成分、红花20个活性成分、川芎7个活性成分、当归2个活性成分,剔除重复数据,血必净注射液共有116种活性成分,见表1。

2.2 血必净注射液活性成分-靶点网络图

以网络节点中的拓扑结构特征值“连接度(degree)”成分-靶点网络图中,364个节点,1 687条相互作用关系(图1),即选择degree大于其中位数值2倍以上的节点作为关键候选靶点(degree≥18),得到关键靶点59个节点,595条相互作用关系,其中关键成分29个。以degree排序前10进行展示(表2),分别是槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素、山柰酚、丹参酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亚甲丹参新酮、二氢异丹参酮。

2.3 基于抗炎,调节免疫作用血必净注射液治疗COVID-19的潜在靶点

基于TTD、DisGeNT数据库构建COVID-19的免疫与炎症反应靶点541个。利用在线韦恩图工具,将COVID-19基因靶点与血必净注射液活性成分靶点进行映射得到血必净与COVID-19共同靶点75个(图2A)。通过构建成分-炎症、免疫靶点网络(图2B),得到159个节点,1 438条相互作用关系。经degree大于中位数值2倍进行筛选,得到关键蛋白靶点55个,关键活性成分4个,864条相互作用关系。其中大于平均中介中心性0.014 5的关键靶点9个(图2C)。

图2 活性成分-炎症、免疫靶点网络

2.4 GO富集与KEGG通路分析

利用DAVID数据库对筛选出的55个关键作用靶点进行GO富集分析及KEGG信号通路富集(P≤0.05)分析。GO富集分析得到GO生物进程(biological process,BP)93个,包括RNA聚合酶II启动子转录的正调控、炎症反应、内毒素调节信号通路、血管生成、免疫反应、调节细胞增殖等生物过程,分子功能(molecular function,MF)17种,细胞组分(cellular component,CC)11种。根据P值进行排序,选择前10个进行展示(图3)。

图3 GO富集分析

KEGG通路分析得到通路87条,与炎症免疫相关27条,包括toll样受体信号通路、甲型流感、T细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、炎症性肠病(IBD)、NF-κB信号通路、细胞因子间受体的相互作用、PI3K-Akt信号通路、RIG-I样受体信号通路(表3、图4)。

图4 KEGG通路分析气泡图

表3 KEGG通路分析

2.5 核心成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶分子对接

将“2.2”与“2.3”关键活性化合物与SARS-Co V-2 3CL水解酶对接,选取结合能<-5 kJ∙mol-1,筛选出12种活性化合物,见表4与图5。

图5 部分关键活性化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶对接结果

表4 关键活性化合物对接结果

3 讨论

COVID-19患者大多表现为发热、乏力和干咳等症状,预后良好。但少数重型和危重型患者可快速进展为脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官衰竭等,往往预后不良。而研究发现SARS-Co V-2感染导致的免疫反应过激与炎症因子风暴是上述并发症产生,以及患者死亡的罪魁祸首[3]。血必净注射液是我国被批准治疗脓毒症、全身炎症反应综合征及多器官衰竭的中成药,由丹参、红花、当归、赤芍、川芎组成,起效迅速、疗效显著[13]。自COVID-19暴发以来,血必净注射液在治疗危重型肺炎患者中发挥重要作用[14]。但其具体作用于SARS-Co V-2的分子机制尚不十分清楚。因此,本研究采用网络药理学方法结合分子对接技术,从“药物-靶点-通路”角度入手,探讨血必净注射液治疗SARS-Co V-2的分子机制,为临床合理应用提供科学依据。

利用TCMSP收集血必净注射液共有116种活性成分。经TCMSP、DrugBank数据库筛选关键靶点59个节点,595条相互作用关系,其中关键成分29个。排序前十的核心化合物分别为槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄芩素、山柰酚、丹参酮IIA、鼠尾草酚酮、4-亚甲丹参新酮、二氢异丹参酮。经TTD、DisGeNT数据库筛选出COVID-19相关的免疫与抗炎相关靶点541个,在这些靶点中,血必净与COVID-19交集有75个共同靶点。构建中药-成分-靶点网络图;利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络图,筛选出关键蛋白靶点55个,关键活性成分4个,864条相互作用关系。其中大于平均中介中心性0.014 5的关键靶点9个,分别是PTGS2、IL6、PTGS1、ADRB2、NR3C1、PPARG、VEGFA、TP53、HSP90AA1。

GO富集分析结果显示,与关键靶基因相关的生物过程主要涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控、炎症反应、内毒素调节信号通路、血管生成、免疫反应、调节细胞增殖等生物过程,提示血必净注射液通过调控这些生物过程从而抗COVID-19。KEGG通路分析关键靶点与免疫炎症相关27条,包括toll样受体信号通路、甲型流感、T细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、炎症性肠病(IBD)、NF-κB信号通路、细胞因子间受体的相互作用、PI3K-Akt信号通路、RIG-I样受体信号通路,其中NF-κB信号通路在炎症反应和免疫调节中发挥重要作用[15-16],可减轻SARS-Co V-2引起炎性因子释放和异常增多,减少肝、肺、肾等组织的损伤[17-18]。同时发现,IL6、PTGS2等靶点参与上述多条炎症信号通路,表明血必净注射液可通过免疫调节,抑制细胞释放炎性因子,从而降低SARS-Co V-2对肺组织的损伤,促进肺部细胞的修复与再生,达到缓解肺炎症状的效果[19]。分子对接结果显示,血必净注射液主要活性成分与SARSCo V-2 3CL水解酶这一具有较好的结合活性,分子构象结合稳定,进一步验证了血必净注射液可通过与SARS-Co V-2靶蛋白结合起到抗COVID-19的作用。

综上,本研究以血必净注射液的活性成分、靶蛋白、信号通路的调控网络为基础,通过网络药理学、分子对接揭示血必净注射液对COVID-19免疫调节与抑制炎症的作用机制,为临床应用血必净治疗重症COVID-19患者提供理论参考。