铜绿假单胞菌对乳制品中沙门氏菌检测的干扰作用评价

◎ 燕如娟，刘芳玉

（飞鹤（甘南）乳品有限公司，黑龙江 齐齐哈尔 162100）

沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，无芽孢，无荚膜，周身鞭毛，在自然界中分布广泛，是一种最为常见的食源性致病菌。在世界各国的细菌性食物中毒中，有沙门氏菌引起的食源性食物中毒往往高居首位[1-2]，在我国有高达80%的食物中毒是由沙门氏菌所引起[3]，国内外的很多食品安全相关标准中都有明确规定各类食品中均不得检出沙门氏菌。因此，沙门氏菌的正确检出对于保障居民饮食卫生安全具有极其重要的现实意义。

现行的沙门氏菌标准检测方法为传统培养法，主要包括前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生化实验和血清学分离鉴定5大步骤[4]。然而食品中往往存在大量杂菌影响沙门氏菌在选择性平板的分离与鉴定。近年来对于沙门氏菌分离与鉴定过程中干扰菌的研究多聚焦于弗氏柠檬酸杆菌和奇异变形杆菌[5]，然而本实验室在进行沙门氏菌检出能力测试时发现铜绿假单胞杆菌对沙门氏菌的检验效果同样可以产生极大干扰。在本实验中，将铜绿假单胞菌作为干扰菌株，分别评价不同的前增菌时间下各品牌增菌液对沙门氏菌检出效果的影响，为提高食品中沙门氏菌检测结果的准确性提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、铜绿假单胞菌（ATCC 9027），均购自美国菌种保藏中心。

1.2 设备与材料

36.0 ℃恒温培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；42.0 ℃恒温培养箱，购自德国Memmert；2～8 ℃冰箱，购自青岛海尔集团；台式振荡器，购自哈尔滨市东联电子设备有限公司；电子天平（感量0.1 g），购自梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；无菌试管，购自黑龙江立高仪器设备有限公司；一次性移液管，1 mL（具0.01刻度），10 mL（具0.1刻度），购自NEST；无菌培养皿，购自广东华粤集团；一次性定量接种环，购自广东环凯生物技术有限公司；微量移液器，购自北京大龙兴创实验仪器股份公司；生物安全柜，购自哈尔滨市东联电子设备有限公司；全自动微生物生化鉴定药敏分析仪，购自美国BD公司。

1.3 培养基及试剂

缓冲蛋白胨水（BPW），分别购自品牌A、品牌B、某品牌C，四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、脑心浸液肉汤（BHI）培养基、营养肉汤（NA）琼脂、亚硫酸铋（BS）琼脂和沙门氏菌属显色培养基，所用培养基和试剂均按操作说明书进行，使用前均通过GB 4789.28—2013规定的质控测试。

1.4 实验方法

1.4.1 菌液制备

将冻存的鼠伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌分别接种于10 mL BHI培养基中，36.0 ℃静置培养24 h后，用无菌生理盐水将复苏后的菌液梯度稀释至10-7，分别吸取1 mL菌悬液涂布于NA平板和沙门氏菌显色平板，36.0 ℃培养24 h后进行细菌计数。

1.4.2 样本制备

各称取25 g奶粉溶于225 mL不同品牌的BPW增菌液中，按表1所示分别向每份奶粉样品中人工污染相应剂量的沙门氏菌和铜绿假单胞菌，充分混匀。

表1 人工污染奶粉样本沙门氏菌及铜绿假单胞菌接种量表

1.4.3 前增菌及选择性增菌

将人工污染后的样本置于36 ℃静置培养10 h和18 h，分别吸取1 mL增菌液接种于10 mL TTB内，于42.0 ℃培养24 h。同时，另取1 mL增菌液转种于10 mL SC内，36.0 ℃静置培养24 h，进行选择性增菌。

1.4.4 选择性平板分离

将使用不同品牌增菌液前增菌10 h和18 h的沙门氏菌污染样本对应的TTB、SC二次增菌液分别用直径3 mm的接种环划线接种于沙门氏菌显色平板36.0 ℃培养24 h和BS平板，36 ℃培养48 h，进行沙门氏菌的选择性分离，同时观察菌落形态。

1.4.5 生化鉴定

参照GB 4789.4-2016沙门氏菌检测的食品安全国家标准挑取沙门氏菌显色平板及BS平板上的典型特征菌落进行生化鉴定。

2 结果与分析

2.1 沙门氏菌及铜绿假单胞菌在不同平板上生长特性比较

分别将复苏后沙门氏菌及铜绿假单胞菌稀释并涂布于NA平板和沙门氏菌显色平板，进行细菌计数，结果如表2所示。结果证实铜绿假单胞菌在沙门氏菌显色平板的回收效率显著降低。

表2 沙门氏菌及铜绿假单胞菌在不同平板上生长特性比较表（单位：CFU）

2.2 不同品牌BPW增菌后，分离平板菌落形态及颜色对比

应用不同品牌增菌液进行前增菌并进行选择性增菌后，分离平板菌落形态无显著差异，分离平板菌落形态及颜色有差异。应用不同品牌的BPW，分别进行10 h和18 h增菌，分离平板上的菌落也有所差异，见表3。

表3 样本中沙门氏菌显色平板菌落形态及颜色表

2.3 生化鉴定结果

将使用不同品牌增菌液前增菌10 h和18 h的沙门氏菌污染样本对应的TTB、SC二次增菌液分别划线接种于沙门氏菌显色平板及BS平板，待长出单菌落后挑取特征性菌落划线接种于NA平板，36 ℃培养24 h后上机鉴定，鉴定结果见表4。

表4 样本中沙门氏菌及铜绿假单胞菌生化鉴定结果表

2.4 沙门氏菌和铜绿假单胞菌在沙门氏菌选择性平板上菌落形态比较

沙门氏菌和铜绿假单胞菌在沙门氏菌显色选择性平板上有些菌落虽具有相似的显色情况，但铜绿假单胞菌菌落紫色较淡，菌落边缘为淡色，多成无定形长。在BS平板上菌落形态具有明显差异，详见表5。

表5 沙门氏菌和铜绿假单胞菌在沙门氏菌选择性平板上菌落形态比较表

3 结论与讨论

本实验参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）对人工污染不同浓度沙门氏菌及铜绿假单胞菌的无菌奶粉样本进行检验，使用NA平板和沙门氏菌显色平板进行细菌计数，结果证实铜绿假单胞菌在沙门氏菌显色平板的回收效率显著降低。通过应用不同品牌BPW对样本进行前增菌，探究了铜绿假单胞菌作为干扰菌株对沙门氏菌检出效果的影响。结果表明应用不同品牌的增菌液进行前增菌，菌落形态无明显差异，增菌效果略有不同，但均能够检出沙门氏菌阳性样本。此外应用品牌A增菌液进行前增菌后，沙门氏菌显色平板有显著的蓝绿色铜绿假单胞菌典型菌落长出，应用品牌A增菌液与品牌C增菌液前增菌时间从10 h延长至18 h，分离后沙门氏菌平板上蓝绿色菌落增多，两者出现典型菌落的比例明显降低，BPW为非选择性培养基，当干扰菌的含量明显高于目标菌时，这种放大效应就会更明显。研究表明前增菌时间过长会使沙门氏菌的分离效果下降，对沙门氏菌的检出效果有一定的影响。相比于使用品牌A和品牌C增菌液进行前增菌，使用品牌B增菌液进行前增菌，最终沙门氏菌的检出率更高。因此为保证沙门氏菌检测的准确性和提高检出效率，在检验过程中，应根据对样品污染程度的估计，结合检验标准的规定，合理选择前增菌时间。