处州白莲莲房原花青素延缓衰老作用研究

◎ 于金英，全奕洁，王 津，汪 冶

（丽水学院，浙江 丽水 323000）

莲 房（Lotus Seed Pot，LSP），莲（Nelumbium nuciferum）的成熟花托，是莲子收获过程同时产生的农副产品，莲房中含有大量的原花青素（procyanidins，PC）成分，原花青素大多具有明显的抗氧化、抗衰老作用[1,2]。原花青素是由不同数量的儿茶素或表儿茶素单体及其聚合体形成的多酚化合物[3]，按聚合度大小进行分类，一般将聚合度为2～4的称为低聚体（Proamhocyanidins Oligomers），简称OPC，将聚合度≥5的称为高聚体（Proamhocyanidins Polymers），简称PPC。原花青素抗氧化活性受聚合度的影响，莲房原花青素低聚体（LSOPC）与高聚体（LSPPC）延缓衰老作用是否具有差异性尚未可知。秀丽隐形线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans），又称秀丽线虫，是一种无毒无害、可以独立生存的线虫。本研究利用DPPH•清除试验以及模式生物秀丽线虫寿命试验对莲原花青素（LSPC、LSOPC和LSPPC）延缓衰老作用进行评价，并对作用机制进行初步的探讨。本研究为莲副产品经济价值的提升和莲原花青素的功能开发提供重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

处州白莲蓬购买于浙江省丽水市莲都区老竹镇处州白莲种植基地，剥除莲子，将莲蓬自然阴干。N2野生型秀丽线虫（C.elegansN2）、大肠杆菌（Escherichia coli）OP50（E.coliOP50）从Caenorhabditis Genetics Center（University of Minnesota，CGC）购买。

1.2 试剂

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。DPPH自由基（DPPH•）标准品（TCI试剂）、甲醇、乙醇等均为分析纯试剂。

1.3 仪器

SMZ-168型体视显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）、GI-54TW型高压灭菌器（厦门致微仪器有限公司）、SHP-150型生化培养箱（上海森信实验仪器有限公司）、TG16G型离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、Wellscan MK 3全自动酶标仪（美国Thermo Scientific公司）。SG250H超声波提取器、HX-5FD真空冷冻干燥设备。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备

（1）莲房原花青素（LSPC）样品制备。选用阴干的去除莲子的干燥莲房若干，用高速粉碎机粉碎，过24目筛，称取适量粉末，经超声波辅助提取（乙醇体积为50%，料液比1∶20，提取3次，提取25 min），离心过滤得到提取液。提取液经过薄层旋转蒸发仪回收酒精后，进行冷冻干燥处理制备莲房原花青素样品。

（2）低聚莲原花青素（LSOPC）和高聚莲原花青素（LSPPC）样品制备。利用莲房原花青素中低聚体和高聚体溶解性差异进行分级分离研究。将上述制备的莲房原花青素样品溶于水[4]，采用等体积的乙酸乙酯萃取3次富集低聚莲房原花青素，回收溶剂制备低聚莲房原花青素（LSOPC）样品。萃取后的水溶液经冷冻干燥制备高聚莲房原花青素（LSPPC）样品。

1.4.2 DPPH•清除试验

（1）DPPH•标准曲线。精密称定DPPH•标准品7.5 mg，甲醇溶解定容至100 mL，配成质量浓度为75 μg·mL-1的标准溶液，分别移取0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL标准溶液，甲醇定容至10 mL，517 nm波长处测定吸光度。以溶液浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

（2）清除DPPH• IC50计算。精密称定制备的待测样品，甲醇溶解，配制成不同浓度的待测样品溶液作为试验组，分别取1 mL样品溶液于10 mL容量瓶中，加入5 mL 75 μg·mL-1的DPPH•标准液，甲醇定容、摇匀，置暗处反应30 min，以甲醇作为参比在517 mm处测定吸光度值，计算待测样品对DPPH•清除率。清除率I=（1-Ac/A0）×100%，其中Ac为样品溶液吸光度，A0为甲醇参比溶液吸光度。对不同浓度样品DPPH•清除率数据进行非线性拟合，计算半数抑制浓度（IC50）。

1.4.3 秀丽线虫寿命试验

（1）样品浓度配制。将样品（LSPC、LSOPC和LSPPC）加入到经过E.coli OP50灭活LB菌液中混均，配制成给药浓度40 µg·mL-1，把混有样品的LB灭活菌液涂布到线虫生长培养基（NGM）培养板表面。

（2）秀丽线虫的同期化与培养。使用NaClO溶液对成虫进行同期化，把新得到虫卵涂到含有E.coli OP50的NGM培养皿中20 ℃下进行培养。

（3）莲原花青素对秀丽线虫寿命的影响。将同期化的L1期N2型秀丽线虫隐杆，转移到含有LSPC、LSOPC和LSPPC的NGM培 养 板，以 不含原花青素样品的NGM培养板上秀丽线虫作为空白对照，每平板中加入30条同期化秀丽线虫，每次寿命观察试验有3组平行试验，每天观察平板上秀丽线虫生长情况，记录死亡秀丽线虫数量，并将死亡秀丽线虫挑出。每2 d更换新鲜培养基，直至所有秀丽线虫死亡，计算秀丽线虫平均寿命，并绘制生存曲线。

（4）抗氧化酶活力测定。将同期化的L1期N2型秀丽线虫分别置于含有LSPC、LSOPC和LSPPC的NGM培养板，20 ℃恒温培养5 d后，EP管收集，加入1 mL磷酸盐缓冲液（pH值6.0）于3 000 r·min-1离心1 min，弃上清液。进一步加入灭菌后的生理盐水洗涤，离心弃上清液，重复3次。超声破碎仪破碎，离心，收集上清液，然后依据超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书进行测定。

1.5 数据处理

采用Graphpad prism5.0绘制生存曲线图和组间多重比较（Two-Way ANOVA），平均寿命采用SPSS 26统计软件中Kalpan-meir存活曲线分析程序进行统计分析，数据采用χ—±s表示。

2 结果与分析

2.1 DPPH·标准曲线

按照1.4.2的方法，绘制出DPPH•的标准曲线，如图1所示。测定标准曲线为y=0.195 1x+0.011，式中：x为DPPH·的质量浓度，μg·mL-1；y为517 nm处吸光值，R2=0.999 7。

图1 DPPH•标准曲线图

2.2 莲房原花青素样品清除DPPH·结果

由图2可知，莲房原花青素（LSPC）、莲房低聚原花青素（LSOPC）、莲房高聚原花青素（LSPPC）清除DPPH•作用有差异性，其中莲房低聚原花青素（LSOPC）清除DPPH•作用较对照组VC强，莲房原花青素（LSPC）和莲房高聚原花青素（LSPPC）清除DPPH•作用较弱。通过比较三者的清除DPPH•作用IC50值（表1），进一步说明莲房低聚原花青素（LSOPC）具有较强的清除DPPH•作用。

图2 莲房原花青素样品对DPPH•清除作用图

表1 莲原花青素对DPPH•清除作用IC50表

2.3 莲原花青素样品对C.elegans N2寿命的影响

由图2可知，莲房原花青素（LSPC）、莲房低聚原花青素（LSOPC）、莲房高聚原花青素（LSPPC）延长秀丽线虫寿命作用有差异性。从表2结果可以得知，3种类型原花青素在40 μg·mL-1时具有比较明显的延长秀丽线虫寿命作用，其中LSOPC对平均寿命的影响最显著，相对于对照组延长平均寿命作用提高了30.38%。

图3 LSPC、LSOPC和LSPPC分别对C.elegans N2寿命的影响图

表2 莲原花青素对C.elegans N2寿命的影响表

2.4 莲原花青素对C.elegans N2抗氧化活性酶（SOD和GSH-Px）的影响

由图4可知，莲房原花青素（LSPC）、莲房低聚原花青素（LSOPC）、莲房高聚原花青素（LSPPC）对秀丽线虫抗氧化酶活性有不同影响，其中LSOPC显著提升了抗氧化活性酶（SOD和GSH-Px）活性。

3 结论与讨论

衰老是复杂的生物学过程，是机体在退化时功能下降及生理功能紊乱的综合表现。1956年HARMON提出了衰老的自由基学说[5]。该学说认为机体的衰老是由于自由基的过氧化反应对细胞产生各种破坏而引起的，维持体内适当的抗氧化剂和自由基清除剂水平，可以延缓衰老和延长寿命。在衰老和相关疾病研究领域，秀丽线虫已经成为研究衰老的理想模式生物[6]。秀丽线虫是研究衰老作用的首选模式生物。因此本研究选择DPPH•清除试验和秀丽线虫寿命试验进行综合评价。天然抗氧化剂具有清除自由基作用和延长寿命作用，具有潜在的应用开发价值。

本研究对3种不同类型莲原花青素（LSPC，LSOPC和LSPPC）进行延缓衰老作用评价，结果显示LSOPC在体外具有显著的体外DPPH•清除作用，且能显著延长模式生物秀丽线虫平均寿命，提示LSOPC具有较好的延缓衰老作用。LSOPC可开发为功能因子来预防和改善衰老。

SOD和GSH-Px是有效清除生物体内活性氧的重要保护酶类，通过催化细胞代谢过程中产生的过氧化氢，从而防止氧自由基的形成。因此，适当增加生物体内SOD和GSH-Px含量有助于抗氧化和延长寿命。LSOPC延长秀丽线虫寿命作用可能与提高SOD及GSH-Px酶活力作用有关。