嘧菌酯与三种外源硒对不同生命阶段斑马鱼的联合毒性

郭志芯, 毛连纲, 张 兰, 张燕宁, 朱丽珍, 蒋红云

(中国农业科学院 植物保护研究所，农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(植物源)控制重点实验室，北京 100193)

嘧菌酯是中国水稻上防治纹枯病和稻瘟病的常用杀菌剂，由帝国化学工业公司 (ICI) 开发，是中国目前登记条目最多的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[1]。其作用机理是抑制线粒体呼吸产生三磷酸腺苷 (ATP) ，从而抑制病原菌的能量合成[2]。嘧菌酯已被列为残留污染物4 类等级 (根据生物累积性和持久性划分为优势、频发、偶然及稀少) 中的频发等级[3]，其对环境生物尤其是水生生物表现出高毒和遗传毒性，欧洲食品安全局 (EFSA) 评估其对水生生物剧毒[4]。斑马鱼暴露于1 500 mg/L 的嘧菌酯中会分别在24、48、72 和96 h 出现形态异常，如尾部畸形、心包水肿、卵黄囊水肿和脊柱弯曲等，并影响其线粒体功能，出现氧化应激、细胞凋亡和先天免疫反应等，甚至影响其生殖功能[5-9]。

目前，功能农业作为中国现代农业转型升级的重要战略方向，受到越来越多的关注。硒(Se)是人体和动物体必需微量元素，其特殊作用导致富硒农产品得到快速发展[10]。生产中利用硒肥和硒饲料是获得富硒农产品的主要技术手段，但硒也是一把“双刃剑”，不同形态外源硒大量应用于生产富硒农产品，在满足人畜正常补硒需求的同时，也对生态环境及人体健康形成潜在威胁。硒具有蓄积、传递和富集特性，超出营养剂量需求的硒对水生生物如斑马鱼Danio rerio表现出致畸、生长发育毒性及种群繁衍毒性效应[11-12]。日本青鳉Oryzias latipes暴露于水相亚硒酸盐或纳米硒后，其肝脏中的超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性显著降低[13]；大鳞裂尾鱼Pogonichthys macrolepidotus在摄食含有富硒酵母的食物后 (硒质量分数57.6 mg/kg)，肝脏出现胞质蛋白油滴、脂肪泡萎缩变性等现象[14]。

嘧菌酯在水稻田施用时期为纹枯病发病初期(即水稻分蘖末期)[15]和稻瘟病发病时期 (即水稻整个生育时期，其中以4 叶期至分蘖期、抽穗期最易感病)[16]；而硒肥多集中在水稻齐穗期和抽穗期施用[17]。硒在环境中的生物吸收转化利用率很低[18]，未被吸收的硒在土壤和水体环境中日积月累，有可能与嘧菌酯等农药在稻田水生生态系统中形成复合污染。目前，有关嘧菌酯或硒对水生生物的单一毒性效应研究较多[5-9,11-14]，但两者的联合毒性效应尚未见报道。开展嘧菌酯与不同类型硒的二元联合毒性效应研究，可以为硒与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的科学安全应用提供指导，从而促进富硒产业和农作物病害防治的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 供试生物与饲养条件

1.1.1 斑马鱼成鱼 斑马鱼Danio rerio成鱼购于北京高峰水族馆，体长3.00～4.00 cm，体重0.15～0.30 g。在试验室驯养15 d 以上，驯养用水经曝气去氯处理 (简称曝氧水)，pH 值为7.0～8.5，水中溶氧量饱和度大于80%，水温(27±1) ℃。保持光照/黑暗(14 h/10 h)循环。驯养期间每天喂食适量鱼饲料，至试验开始前24 h 为止。驯养期间正常死亡率保持在5%以下。

1.1.2 斑马鱼亲鱼 采用野生型AB 品系，购于国家斑马鱼资源中心 (武汉)，在本实验室进行饲养繁殖，试验过程严格遵守动物伦理学操作规范。斑马鱼养殖条件为：独立养殖系统 (北京爱生科技发展有限公司) 饲养繁殖斑马鱼，保持光照/黑暗 (14 h/10 h) 循环，室温 (28.0±0.5) ℃；水循环系统使用处理后的自来水 (简称重组水)，即经过除杂、除氯、净化和紫外消毒，添加氯化钠和碳酸氢钠，保持电导率为 (500±50) μS/cm，水温(26±1) ℃，pH 值为7.0～7.5；废物处理系统自动过滤鱼的粪便和剩余鱼食，废水排出后自动补充新鲜养鱼水。每日喂食丰年虾3 次。

1.1.3 试验用胚胎 于试验开始前一天下午，挑选健康、发育一致的成年斑马鱼亲鱼 (10 月龄)，按照雌雄比例1 : 1 转移到配鱼盒内，用隔板隔开，配鱼盒环境条件与斑马鱼亲鱼养殖条件一致。次日光照开始后，抽隔板，收集受精2 h 的胚胎用于胚胎毒性暴露试验。

1.1.4 试验用仔鱼 首先收集受精2 h 的胚胎 (方法同1.1.3 节)，正常孵化后，挑选孵化后72 h 的正常仔鱼用于仔鱼毒性暴露试验。

1.2 仪器与试剂

Nano-ZS 型激光粒度仪 (英国马尔文公司)；SG68 多参数测试仪 (梅特勒-托利多仪器有限公司)；YD300 便携式水质硬度仪 (上海三信仪表厂)；24 孔细胞培养板 (美国康宁公司)；BX63 奥林巴斯生物显微镜 (奥林巴斯株式会社)；TG16-WS 型台式高速离心机 (长沙湘仪离心机仪器有限公司)；Agilent 6 470 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪 (安捷伦科技有限公司)；AVIO200 型电感耦合等离子体发射光谱仪 (珀金埃尔默企业管理(上海) 有限公司)。

98%嘧菌酯 (azoxystrobin) 原药，购于连云港市金囤农化有限公司；亚硒酸钠 (sodium selenite)，纯度99%，购于AMRESCO, LLC；硒代蛋氨酸(selenomethionine)，纯度98%，购于百灵威科技有限公司；1 500 mg/L 的纳米硒 (nano-selenium)母液，由中国农业大学理学院农药创新研究中心潘灿平教授课题组提供。

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) (天津博纳艾杰尔科技有限公司)。

1.3 药剂暴露试验

1.3.1 单一药剂暴露试验

1.3.1.1 对斑马鱼成鱼的毒性试验 参照化学农药环境安全评价试验准则[19]和OECD 203[20]设计试验。用适量丙酮配制1 000 mg/L 的嘧菌酯母液，用重组水分别配制10 000 mg/L (mg 指硒Se 元素的质量，通过硒元素的相对原子质量和亚硒酸钠的相对分子质量将亚硒酸钠的质量浓度换算得到，下同) 的亚硒酸钠母液、1 000 mg/L 的硒代蛋氨酸母液和1 000 mg/L 的纳米硒母液。将随机挑选的斑马鱼成鱼分别暴露于0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 的嘧菌酯系列溶液，1.55、3.10、6.20、12.38、24.76 mg/L 的亚硒酸钠系列溶液，1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mg/L 的硒代蛋氨酸系列溶液和0.23、0.35、0.52、0.78、1.17、1.76、2.63 mg/L 的纳米硒系列溶液中。暴露试验在5 L 鱼缸中进行，每个鱼缸中盛有药液3 L 和10 条成鱼作为一个重复。同时设空白对照 (重组水)和溶剂对照 (体积分数0.01%的丙酮水溶液)，每处理3 次重复。分别观察处理24、48、72 和96 h 斑马鱼的死亡数和中毒症状，及时清理死鱼。判断死鱼的标准是用玻璃棒轻触鱼的尾部无可见运动。每24 h 更换全部药液。

1.3.1.2 对斑马鱼仔鱼的毒性试验 参考Giari等[21]的方法，挑选孵化后72 h 的正常仔鱼供试。用适量丙酮配制60 mg/L 的嘧菌酯母液，用重组水分别配制150 mg/L 的亚硒酸钠母液、硒代蛋氨酸母液和纳米硒母液。将仔鱼分别暴露于0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 的嘧菌酯系列溶液，0.51、0.77、1.16、1.73、2.60 mg/L 的亚硒酸钠系列溶液，0.44、0.57、0.74、1.04、1.45 mg/L 的硒代蛋氨酸系列溶液和0.52、0.78、1.17、1.76、2.63、3.95 mg/L 的纳米硒系列溶液中。试验在200 mL 烧杯中进行，每个烧杯中盛有药液100 mL 和10 条仔鱼作为一个重复。同时设空白对照(重组水)和溶剂对照 (体积分数0.01%的丙酮水溶液)，每处理3 次重复。分别观察24、48、72 和96 h 的死亡数和中毒症状，以显微镜观察无可见心跳作为判断仔鱼死亡的标准，及时清理死鱼。每24 h 更换80%药液。

1.3.1.3 对斑马鱼胚胎的毒性试验 参照OECD 210[22]和Fraysse 等[23]的方法进行。母液配制同上述仔鱼试验。将斑马鱼胚胎分别暴露于0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L 的嘧菌酯系列溶液，1.31、1.98、2.96、4.44、6.67、10.0 mg/L 的亚硒酸钠系列溶液，0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mg/L的硒代蛋氨酸系列溶液和1.76、2.63、3.95、5.93、8.89、13.33 mg/L 的纳米硒系列溶液中。将胚胎转移到24 孔板中，每板使用20 个孔，每孔含有2 mL试验药液和1 枚受精卵。1 张板为1 个重复，每处理3 次重复。同时设空白对照 (重组水) 和溶剂对照 (体积分数0.01%的丙酮水溶液)。药液每24 h更换一次。将24 孔板转移到恒温培养箱中于 (26±1) ℃下培养，观察24、48、72 和96 h 的死亡数及中毒症状，期间及时清理死亡的卵或幼鱼，并记录死亡数。胚胎死亡的判定标准为是否出现乳白色凝结或发育停滞，幼鱼无心跳即判定为死亡。胚胎观察以及图像采集使用奥林巴斯生物显微镜。

1.3.2 混合药剂暴露试验 将嘧菌酯分别和亚硒酸钠、硒代蛋氨酸及纳米硒两两二元混合进行联合毒性试验。以单一药剂对斑马鱼成鱼、仔鱼和胚胎的96 h-LC50值作为各自的毒性单位，采用等毒性配比的二元混合体系设置系列浓度梯度，成鱼分别暴露于嘧菌酯 + 亚硒酸钠系列溶液、嘧菌酯 + 硒代蛋氨酸系列溶液以及嘧菌酯 + 纳米硒系列溶液 (具体质量浓度设置见表1)；仔鱼分别暴露于嘧菌酯 + 亚硒酸钠系列溶液、嘧菌酯 + 硒代蛋氨酸系列溶液以及嘧菌酯 + 纳米硒系列溶液 (具体质量浓度设置见表1)；胚胎分别暴露于嘧菌酯 +亚硒酸钠系列溶液、嘧菌酯 + 硒代蛋氨酸系列溶液以及嘧菌酯 + 纳米硒系列溶液 (具体浓度设置见下表1)；同时设空白对照 (重组水) 和溶剂对照(体积分数0.01%的丙酮水溶液)，每个处理3 次重复。试验方法同上。

表1 二元混剂对斑马鱼不同生命阶段的急性毒性试验质量浓度设置Table 1 The concentrations set in joint acute toxicity test of binary mixtures on adult zebrafish (D. rerio)during different life stages

1.4 供试药剂含量测定

1.4.1 混剂水样中嘧菌酯含量测定

分析条件：采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS) 法检测，ACQUITYUP LC BEH C181.7 μm 色谱柱，采用梯度洗脱，柱温30℃，进样体积5 μL。质谱采用ESI (电喷雾离子源) 正源多重反应监测 (MRM) 模式，母离子 (m/z) 是403.9，子离子 (m/z) 为343.9 和271.9。离子源温度150 ℃，脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气流量600 L/h，锥孔气流量50 L/h。

溶剂标准曲线绘制：以乙腈为溶剂将嘧菌酯标准品配制成质量浓度为150 mg/L 的标准储备液，再分别稀释成0.006、0.03、0.15、0.6、3 mg/L的系列标准工作溶液。在设定的条件下进样分析，以嘧菌酯质量浓度为横坐标，检出峰面积为纵坐标进行线性回归。

基质匹配标准曲线绘制：分别吸取3 mL 重组水于10 mL 离心管中，加入嘧菌酯标准储备液，使其质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、3 mg/L，加入3 mL 乙腈，振荡后加入1.5 g 氯化钠，振荡后离心。取1 mL 上层液体过0.22 μm 有机滤膜于进样瓶中，待测。每个浓度重复3 次。在设定的条件下进样分析，以嘧菌酯质量浓度为横坐标，检出峰面积为纵坐标进行线性回归。

添加回收试验：分别吸取3 mL 重组水于10 mL 离心管中，加入嘧菌酯标准储备液，使其质量浓度分别为0.05、0.5、5 mg/L，样品处理方法同上述基质匹配标准曲线绘制。每个浓度重复5 次，同时设置基质空白组。

混剂水样中嘧菌酯含量测定：对试验初始浓度 (0 h) 及换药液前浓度 (24 h) 进行实测分析。因成鱼摄食量和活动量较仔鱼和胚胎更大，对药液中药物含量的稳定性影响更大，本文仅选取成鱼暴露药剂进行实测分析。每个重复中分别取3 mL不同组的试液于10 mL 离心管中，操作方法同上。

1.4.2 混剂水样中总硒含量测定 按照中国国家标准GB 5009.268—2016《食品中多元素的测定》中电感耦合等离子体发射光谱法 (ICP-OES)[24]对试验初始浓度 (0 h) 及换药液前浓度 (24 h) 的总硒含量进行实测分析。

具体操作为：各混剂水样采集后采用湿式消解法消解，取定容后样品过0.45 μm 水系微孔滤膜，待测。AVIO200 型电感耦合等离子体发射光谱仪分析条件：观测方式垂直观测，功率1 300 W，等离子气流量12 L/min，辅助气流量0.2 L/min，雾化气气体流量0.6 L/min，分析泵速1.5 mL/min。测定硒元素采用的分析谱线波长为196.026 nm。

1.5 联合毒性评价方法

混合污染物的联合毒性采用以下3 种方法进行评定[25]。

第1 种方法，加和指数 (Additional Index, AI)法[26]。采用公式为S=Am/A1+Bm/B1+···。式中：S为生物毒性相加作用之和；A1、B1分别为A、B 等毒物的毒性 (LC50值) ；Am、Bm为混合物毒性中各毒物的毒性 (LC50值) 。当S≤1 时，AI=1/S−1；当S>1 时，AI=1.0−S。用AI 评价农药的联合效应：AI>0 时为协同作用，AI<0 时为拮抗作用，AI=0 时为相加作用。

2 结果与分析

2.1 纳米硒样品表征

采用Nano-ZS 型激光粒度仪对试验用纳米硒溶液进行表征后发现，硒纳米粒子粒度分布均匀，强度分布呈正态，平均粒径约为150 nm (图1)。

2.2 混剂中各药剂的浓度分析

2.2.1 嘧菌酯浓度实测分析方法有效性 嘧菌酯溶剂标准曲线检测结果表明：在0.006～3 mg/L 范围内，嘧菌酯质量浓度与对应的峰面积呈良好的线性关系，其线性回归方程为y=192.59x+ 49 948.96(R2=0.995)。基质标准曲线检测结果表明：在0.01～3 mg/L 范围内，嘧菌酯质量浓度与对应的峰面积间呈良好的线性关系，其线性回归方程为y=30.27x+ 2 321.49 (R2=0.996)。嘧菌酯添加回收结果见表2，其平均添加回收率在101%～107%之间，相对标准偏差 (RSD) 在0.57%～6.3%之间，表明该方法具有较好的准确性及重现性。

表2 嘧菌酯在重组水中的平均添加回收率Table 2 Average recoveries of azoxystrobin added to the reconstituted water

2.2.2 混剂中嘧菌酯和总硒的浓度实测分析 结果表明，所有混剂处理组水样中各药剂成分的0 h和24 h 的实测浓度与理论浓度比值均满足80%～120% 的要求 (表3) ，说明各药剂成分的浓度在24 h 内相对稳定，因此，可用试验设定理论浓度代替实测浓度，用于各药剂成分对斑马鱼的急性毒性数据分析。

表3 二元混剂对斑马鱼成鱼急性毒性试验浓度含量测定Table 3 The measured concentrations in joint acute toxicity test of binary mixtures on adult zebrafish (D. rerio)

2.3 嘧菌酯、3 种外源硒单剂及其二元联合的混剂对斑马鱼不同生命阶段的急性毒性

嘧菌酯、3 种外源硒单剂及其二元等毒性配比的混剂对斑马鱼不同生命阶段的急性毒性试验结果见表4。

由表4 数据可见，斑马鱼对亚硒酸钠的敏感性 (以96 h-LC50(致死中浓度)表示)顺序为：仔鱼>胚胎>成鱼。胚胎孵化过程中出现心包水肿，卵黄囊水肿。成鱼中毒症状为：鱼体侧翻，失去平衡。尾部色素沉积，尾鳍部出血；对硒代蛋氨酸的敏感性 (以96 h-LC50表示)顺序为: 仔鱼>胚胎>成鱼。胚胎孵化过程中尾部分化不完全或畸形，孵化的仔鱼出现心包水肿。成鱼中毒症状为：鱼体不规则上下游动，鳃出血，鱼体弯曲。斑马鱼对纳米硒的敏感性 (以96 h-LC50表示)顺序为：成鱼>仔鱼>胚胎。胚胎孵化过程中，孵化后的仔鱼出现心包水肿，脊柱弯曲。供试仔鱼出现心包水肿，卵黄囊水肿，严重时脊柱弯曲约成直角，72 h可见心跳微弱，眼部抽搐。成鱼中毒症状为：鱼体侧翻，出现不规律游动，色素沉积，严重时呼吸微弱，翻白肚，并伴有鳃出血等现象。

表4 嘧菌酯与3 种外源硒单剂及其二元等毒性配比的混剂对斑马鱼不同生命阶段的急性毒性Table 4 Joint acute toxicity of binary mixtures in equitoxicity ratios of azoxystrobin and three kinds of exogenous selenium on zebrafish (D. rerio) during different life stages

2.4 混剂对斑马鱼不同生命阶段的联合毒性评价

分别采用AI 法、TU 法和MTI 法进行联合毒性评价，结果如表5 所示，发现除MTI 法计算嘧菌酯与硒代蛋氨酸对成鱼表现为部分相加作用外，采用AI 法、TU 法和MTI 法等3 种方法计算嘧菌酯与亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和纳米硒对斑马鱼成鱼、仔鱼和胚胎的联合作用结果一致，均表现为拮抗作用。

表5 嘧菌酯与3 种外源硒的二元等毒性配比的混合体系联合毒性评价和作用类型Table 5 Joint toxicity evaluation and mode types of binary mixtures in equitoxicity ratios of azoxystrobin and three kinds of exogenous selenium

3 结论与讨论

从结果可以看出，3 种外源硒对同一生命阶段斑马鱼的影响存在差异，对于胚胎和仔鱼而言，硒代蛋氨酸的毒性最大，其次是亚硒酸钠和纳米硒，但对于成鱼而言则是纳米硒的毒性最大。严旭霞等[30]研究表明，25 nm 的纳米硒对斑马鱼胚胎毒性大于DL-硒代蛋氨酸，与本试验中纳米硒对胚胎毒性最低结果不一致 (本试验纳米硒平均粒径约为150 nm)，这可能由于纳米颗粒不同粒径的尺寸效应导致。对于硒代蛋氨酸毒性大于亚硒酸钠毒性，Bell & Cowey[31]在大西洋鲑鱼的消化率试验中观察到，其对硒代蛋氨酸中的硒利用率最高 (91.6%)，其次是亚硒酸钠 (63.9%)。不同类型硒的代谢途径不同，导致硒在生物体内的蓄积量不同，少量无机硒会结合到受体蛋白中，大多数无机硒未能用于合成硒蛋白而进入肾脏，最终排出体外；硒代蛋氨酸可以代替硫氨基酸结合到受体蛋白中。这与Dolgova 等[32]的研究结果一致，其研究称有机硒比无机硒对斑马鱼幼鱼的毒性更大，推测可能与生物蓄积水平相关。

在AI 法、TU 法和MTI 法3 种联合毒性评价方法中，除采用MTI 法计算嘧菌酯与硒代蛋氨酸对成鱼表现为部分相加作用外，采用其余方法计算嘧菌酯与亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和纳米硒对斑马鱼成鱼、仔鱼和胚胎的联合作用结果一致，均表现为拮抗作用。通过测定供试混剂中嘧菌酯和不同外源硒二元混合之后的各自浓度，二者在水中浓度未受到明显影响，说明二者混配不会发生化学反应。二元联合表现出的拮抗作用的具体机理尚不明确，推测可能是供试斑马鱼对两种不同成分在吸收和代谢方面存在差异。同时，拮抗作用也可能与混剂中硒与嘧菌酯的配比有关。近年来诸多文献报道硒对受重金属污染的动植物有修复作用，如Se-Hg 间存在拮抗作用[33]，而拮抗作用指两种或多种药物同时或相继使用时，可导致药物效应的减弱或消失。在本研究中，硒是否对暴露农药中的供试生物有同样作用机理进而表现为拮抗效应尚不清楚，目前农药和硒联合使用对田间生物的影响尚未见报道，具体的拮抗机理也有待进一步研究。