三唑类杀菌剂在蔬菜中的残留分布及对不同人群的累积性膳食摄入风险

刘翠玲, 张 冉, 杨桂玲, 王 豆,于重重, 孙晓荣, 吴静珠

(1. 北京工商大学 人工智能学院，北京 100048；2. 北京工商大学 食品安全大数据技术北京市重点实验室，北京 100048；3. 浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，杭州 310021)

蔬菜在人们日常饮食结构中占有重要的地位，但由于其生长过程中容易遭受病虫害，为保障蔬菜产量，生产中不合理使用农药的现象较为突出[1]。三唑类杀菌剂作为全球杀菌剂市场中品种最多的一个大类，是生产中最常用的农药之一[2]，常见品种主要包括三唑酮、戊唑醇、烯唑醇、腈菌唑、苯醚甲环唑及丙环唑等[3-6]。三唑类杀菌剂因其高稳定性、半衰期长、不易生物降解、易在环境中扩散等特点，使得其在各种环境介质中被广泛检出[7]。戊唑醇、苯醚甲环唑和丙环唑等经常在水果中被检出，其中戊唑醇在葡萄中的半衰期最长可达 9.8～12.2 d，残留量为 0.002～0.298 mg/kg[8]。研究表明，三唑类杀菌剂在农作物中的半衰期虽然较水果中的短，但其在稻田土壤中的半衰期却可长达 23 d 之久[9]。由于三唑类杀菌剂在多种环境介质中能够长期残留，可能对动物以及人体产生潜在的危害。

已有研究表明，三唑类杀菌剂对水生生物具有一定的毒性。郭晶等[10]测定了17 种三唑类杀菌剂对斑马鱼的96 h-LC50值，其中6 种药剂对斑马鱼为中等毒性，其余11 种为低毒，且存在剂量-效应关系。吴文铸等[11]和葛婧等[12]的研究表明，氟硅唑和腈菌唑对溞类为剧毒。Teng 等[13]研究发现，丙环唑可以显著抑制斑马鱼胚胎和幼鱼的发育，并可造成其脂蛋白脂肪酶和脂肪酸合成酶活性显著降低，以及脂质代谢相关基因表达水平明显上调，具有潜在的健康风险。

对于消费者而言，最常见的农药暴露途径是通过食物摄入[14]。Humbert 等[15]发现，农药的膳食摄入途径暴露量比其他接触途径高出5 个数量级。此外，人群也更容易同时暴露于多种污染物之中。2018 年欧盟的 “食品中农药残留风险监测结果” 显示[16]，在所分析的91 015 个样品中，有43 542个样品 (占47.8%) 检出了一种或多种农药残留，在来自中国的一个枸杞样品中同时检出了29 种不同的农药。与暴露于单一农药残留相比，同时暴露于多种农药中可能引起更高的风险。美国早在1996 年的《食品质量保护法》[17]中就已经要求其环境保护署 (EPA) 在制定农药残留限量 (MRL) 时须考虑多种农药的联合效应。郇志博等[18]对比了啶虫脒和吡虫啉2 种农药的单一暴露与累积性暴露风险，发现2 种农药对8 类人群的累积性暴露风险均高于单一暴露，且累积性暴露的风险商值甚至高于两种农药单一暴露的风险商值之和。

为了探明蔬菜中残留的三唑类杀菌剂可能对人体产生的累积性暴露风险，本研究采用相对效能因子法和概率性评估方法，对产自江苏省、浙江省、上海市、安徽省及福建省5 个地区的蔬菜中的三唑类杀菌剂残留进行了累积性膳食摄入风险评估。

1 材料与方法

1.1 农药残留数据和膳食消费数据来源

1.1.1 农药残留数据

1.1.1.1 蔬菜样本 本实验室于2012–2018 年间在浙江省、江苏省、上海市、安徽省和福建省生产基地和市场采集的蔬菜样本，共包括7 个种类：白菜、豇豆、黄瓜、西红柿、韭菜、青菜类和芹菜，其中白菜样本104 批次(占6.45%)，豇豆718 批次(44.54%)，黄瓜86 批次(5.34%)，西红柿54 批次(3.35%)，韭菜106 批次(6.58%)，青菜类189 批次(11.72%)，芹菜355 批次(22.02%)，总计1 612 批次。各地区样本数量分布及每种蔬菜的占比详见图1。

1.1.1.2 检测方法 采用《水果和蔬菜中450 种农药及其相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20769—2008)[19]，测定蔬菜样本中8 种三唑类杀菌剂 (三唑酮、氟硅唑、苯醚甲环唑、戊唑醇、烯唑醇、丙环唑、抑霉唑和腈菌唑)的残留量。

1.1.1.3 标准品及试剂 三唑酮 (triadimefon，纯度≥97%)、苯醚甲环唑 (difenoconazole，纯度≥95%)、戊唑醇 (tebuconazole，纯度≥96%)、丙环唑(propiconazole，纯度≥95%)、抑霉唑(imazalil，纯度≥97%) 和腈菌唑 (myclobutanil，纯度≥96%) 标准品 (湖北省猫尓沃生物医药有限公司)；氟硅唑 (flusilazole，纯度≥95%)和烯唑醇(diniconazole，纯度≥97%) 标准品 (常熟恒耀新材料有限公司)。试剂乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、甲苯、异辛烷、甲酸铵、二氯甲烷、甲酸及乙酸铵为色谱纯，无水硫酸钠和氯化钠为分析纯。

1.1.1.4 主要仪器 LCMS-8050 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪 (UPLC-MS/MS，日本岛津公司)；多管漩涡振荡器 (杭州米欧仪器有限公司)；Primo R 低温冷冻离心机 (美国热电公司)；HGC-24A 氮吹仪 (天津恒爽有限公司)；BT 25S 电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.1.2 膳食消费数据 蔬菜消费量数据 (表1 和表2) 来源于农药残留联合专家会议 (JMPR )[20]的调查数据。包括6 个不同年龄段人群的蔬菜消费量平均值及大份餐数据(P97.5)。

表1 不同人群的蔬菜大份餐消费量数据Table 1 P97.5 vegetable consumption data of different populations

表2 不同人群的蔬菜平均消费量数据Table 2 Mean vegetable consumption data of different populations

1.2 累积性风险评估方法

为评估多种农药的累积性暴露风险，欧盟食品安全局(EFSA) 专门成立了累积性风险评估工作组，其植物保护产品和残留科学委员会(PPR)提出了多种农药累积性暴露风险评估的方法，并制定了机理相同或相似农药的累积性评估组(cumulative assessment group，CAG)分组标准，为农药的累积性暴露风险评估提供了大量的基础数据[21]。对于同一评估组中的农药, 最常用的几种累积性暴露评估方法包括：危害指数法(hazard index，HI)、相对效能因子法(relative potency factor，RPF)、暴露阈值法(margin of exposure，MOE)及分离点指数法(point of departure index，PODI)[22]。

本研究选用相对效能因子法，该方法适用于机理相同或相似农药的累积性评估组，要求所评估的农药具备相同的毒性终点。该方法的原理是从评估组中选取一个数据充分且具有代表性的农药，作为指示化合物 (index compound，IC)，其他化合物的相对效能因子为指示化合物最大无作用剂量(no observed adverse effect level，NOAEL)和该化合物NOAEL 值之比，将评估组中的农药浓度乘以其相对效能因子，转化为指示化合物的当量浓度，即可将不同农药进行累积。样品中三唑类杀菌剂的累积当量浓度为各农药归一化后相加之和，具体如公式(1)[22]所示。

其中，Ca为三唑类杀菌剂a 的浓度，RPFa为农药a 相对于指示化合物的相对效能因子，C 为累积当量浓度。

1.3 三唑类杀菌剂的相对效能因子

针对三唑类杀菌剂的急性和慢性风险，EFSA分别提出了两个累积性评估组，一是基于对胎儿常见颅骨面部畸形的急性影响，二是基于肝毒性的慢性影响[23]。但是，颅骨面部畸形并不是三唑类杀菌剂最关键的发育毒性效应，而且仅有少数三唑类杀菌剂具有此类毒性；就急性风险而言，则发现大多数三唑类杀菌剂暴露会诱发胎儿的骨骼变异，包括肋骨和未发育好的胸骨，该效应是大多数三唑类杀菌剂所基于的急性效应[23]。

本研究拟选择常见的8 种三唑类杀菌剂进行评估。为了计算其急性和慢性累积性膳食摄入风险，根据共同的毒性机制，急性毒性的RPF 根据影响胎儿骨骼变异的 NOAEL 值进行计算，慢性毒性的RPF 则根据对肝脏毒性的NOAEL 值进行计算。参考Jardim 等[2]在对三唑类杀菌剂进行累积性风险评估时所选择的指示化合物，本研究的急性风险评估选取氟硅唑为指示化合物，慢性风险评估选取苯醚甲环唑为指示化合物。NOAEL 数据主要来自欧盟食品安全局(EFSA) (2009)[23]和JMPR (2007)[24]。表3 列出了本研究考虑的8 种三唑类杀菌剂的急性共同效应(骨骼变异)和慢性共同效应(肝脏毒性)的RPF 值以及NOAEL 值。

表3 供试8 种三唑类杀菌剂的最大无作用剂量和相对效能因子Table 3 No observed adverse effect level and relative potency factor of experimental 8 kinds of triazole pesticides

1.4 未检出值处理方法

由于检测仪器的精确度、检测方法的局限性以及痕量数据的客观存在等原因，导致检测结果中存在很多未检出值，这些未检出值中有一些是低于检出限(LOD)的痕量值[25]。为了更加客观科学地进行评估，尽可能地利用上这部分数据，本研究采用国际公认的替代方法，用1/2 LOD 值替换未检出值进行计算[26]。

1.5 概率评估模型

累积性膳食暴露评估的具体计算有点评估和概率评估两种方式。点评估的结果往往过于保守，而且忽略了农药残留浓度水平不同、个体体重差异以及消费量不同方面的变异[27]。目前概率评估是多种农药累积性风险评估中较为科学准确的一种方式。

1.5.1 慢性膳食摄入风险评估方法 按照国际上普遍认可的风险评估原理和方法，慢性膳食暴露量的通用计算公式见式 (2)[28]。

式中，EDI 代表农产品中农药的每日摄入量估计值，mg/kg (bw)/d；Consi代表第i 种农产品的平均消费量，g/d；Conci为在第i 种未加工农产品中以苯醚甲环唑为指示化合物时的累积当量浓度，mg/kg；bw 代表体重，kg；PFi代表未加工蔬菜中农药的加工因子。本文中在计算未加工蔬菜的农药累积膳食暴露量时将加工因子设置为1。

慢性膳食暴露风险商 (%ADI) 为EDI 与每日参考剂量 (ADI) 之比，具体见式(3)[28]。

当%ADI 小于100% 时认为风险可接受，%ADI 越小，风险越小；当%ADI 大于100%时，表示存在不可接受的风险，%ADI 越大，风险越大。

1.5.2 急性膳食摄入风险评估方法 急性膳食暴露量的通用计算公式见式 (4)[28]。

式中，ESTI 代表农产品中农药的短期摄入量估计值，mg/kg (bw)/d；Conci为在第i 种未加工农产品中以氟硅唑为指示化合物时的累积当量浓度，mg/kg；LPi代表第i 种农产品的大份餐消费量，g/d。

急性膳食暴露风险商 (%ARfD) 为ESTI 与急性参考剂量 (ARfD) 之比，具体见式(5)[28]。

同样，当%ARfD 小于100%时认为风险可接受，%ARfD 越小，风险越小；当%ARfD 大于100%时，表示存在不可接受的风险，%ARfD 越大，风险越大。

1.5.3 概率评估方法 概率评估方法分为参数法和非参数法 2 种。参数法需要先利用合适的分布模型对农药残留数据进行拟合，获得相关参数，从拟合后的分布模型中抽样进行暴露量计算[29]；非参数法则是将原始数据集看作离散的均匀分布，直接从数据集中随机抽样进行暴露量计算。本研究涉及的三唑类杀菌剂残留数据包含较多未检出值，数据高度右偏，没有合适的模型可进行拟合，所以本文采用非参数法。

将蔬菜样本中三唑类杀菌剂残留原始数据先按照式 (1)计算得到累积当量浓度，然后就得到的累积当量浓度数据进行Monte Carlo 模拟，将模拟次数设为10 000 次，得到累积暴露分布，分别计算P50、P97.5、P99 和P99.9 的暴露量，以描述累积暴露评估的变异性 (表征不同人群蔬菜消费量、体重等存在的差异) 。根据文献[30]可知，500～2 000次Bootstrap 抽样可以得出95%置信区间。本文对计算所得累积当量浓度数据进行1 000 次Bootstrap抽样，对每次Bootstrap 抽样得到的样本再进行10 000次Monte Carlo 模拟，计算暴露量，最终得到暴露量的高百分位点置信区间，以定量分析结果的不确定性。具体步骤如下 :

1) 从农药累积当量浓度数据中进行Bootstrap抽样，形成一个Bootstrap 样本。

2) 从Bootstrap 样本中进行10 000 次Monte Carlo 模拟，分别通过式2 (慢性) 或式3 (急性) 计算得10 000 个膳食暴露量数值，计算P50、P97.5、P99 和P99.9 的暴露量，量化变异性。

3) 重复1) 和2) 1 000 次，即可得到1 000 个P50、P97.5、P99 和P99.9 暴露量，据此可计算出P50、P97.5、P99 和P99.9 暴露量的95%置信区间，量化不确定性。

以上模拟过程在python 环境下进行。

在评估累积急性膳食摄入风险时，将不同人群的三唑类杀菌剂累积暴露量 P99.9 值与相应指示化合物的 ARfD 值进行比较；评估累积慢性膳食摄入风险时，将三唑类杀菌剂累积暴露量的P97.5值与相应指示化合物的 ADI 值进行比较[26]。

2 结果与分析

2.1 蔬菜中三唑类杀菌剂残留情况

2.1.1 农药残留检出及超标情况 农药残留监测结果显示：检出率较高的农药及产品组合为芹菜及西红柿中的苯醚甲环唑，检出率分别为 23.1%和 20.4%；其次为黄瓜中的抑霉唑，检出率为16.3%；其他检出率较高的农药还有三唑酮、戊唑醇、氟硅唑、烯唑醇、丙环唑、抑霉唑及腈菌唑。总体而言，苯醚甲环唑在各种蔬菜中的检出率均比其他几种三唑类杀菌剂稍高一些。各蔬菜样本中三唑类杀菌剂的检出情况具体见图2。

在所有批次样本中，共 351 (22%) 批次样本至少含有1 种三唑类杀菌剂，77 (4.8%) 批次样本中含有2～4 种三唑类杀菌剂。本研究所考查的8 种三唑类杀菌剂在样本中均有检测到。

参照《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》(GB 2763―2019)[31]，针对每种蔬菜能够查询到的三唑类杀菌剂最大残留限量 (MRL) 情况进行统计分析，结果显示：共有10 批次黄瓜及1 批次西红柿中抑霉唑残留量超标，超标率分别为11.6%和1.9%；2 批次韭菜及2 批次芹菜中腈菌唑超标，超标率分别为1.9%和0.6% (表4)。同时，本研究检出的农药中约有46%尚未制定在蔬菜中的MRL 标准。

表4 蔬菜中三唑类杀菌剂最大残留限量值及残留量超标情况Table 4 Maximum residue limits of triazole pesticides in vegetables and the situation of excessive residues

三唑类杀菌剂在各种蔬菜中的残留量分布如表5 所示。

表5 蔬菜中三唑类杀菌剂残留情况Table 5 Residues of triazole pesticides in vegetable samples

2.2 累积性风险评估结果

通过计算，得到不同人群因食用7 种蔬菜摄入的三唑类杀菌剂可能存在的急性和慢性膳食暴露量百分位值(P50、P97.5、P99 和P99.9)及其95%置信区间 (表6 和表7)。

El-Shaarawi 等[32]的研究表明：用0 替代未检出值进行计算会低估农药的暴露风险，而采用LOD 值代替未检出值则会高估暴露风险。按照美国 EPA 的建议，选择1/2 LOD 值代替未检出值进行暴露评估更加准确[33]，因此本文采用1/2 LOD值替代未检出值进行计算。

根据表6 和表7 中的数据可看出，不同年龄段人群通过蔬菜摄入的三唑类杀菌剂暴露水平不同，且急性和慢性暴露的规律相同，均随着年龄的增长暴露水平逐渐降低。

表6 蔬菜中残留的三唑类杀菌剂对不同人群的急性累积暴露量Table 6 Acute cumulative exposure of triazole pesticides residues in vegetables to different population

表7 蔬菜中残留的三唑类杀菌剂对不同人群的慢性累积暴露量Table 7 Chronic cumulative exposure of triazole pesticides residues in vegetables to different population

图3 为7 种蔬菜中三唑类杀菌剂残留对累积暴露量的贡献率。从中可以看出，黄瓜是主要的暴露因素，贡献率达 50% ～ 70%；其次为韭菜和西红柿，贡献率分别为10% ～ 30%和6% ～ 14%。其中，黄瓜贡献率较大的原因可能是由于其抑霉唑残留超标情况较严重(11.6%)。抑霉唑对侵袭水果蔬菜的多种真菌病害均有防效，且能够在一定程度上防治储存期瓜果类的腐烂，因此可能造成其施用频率较高，从而导致黄瓜中抑霉唑残留超标情况较为严重。

参考Chen 等[26]的研究，采用蔬菜中三唑类杀菌剂对不同人群累积暴露量的P97.5 值与相应指示化合物的ADI 值进行比较，按式(3) 计算其慢性膳食摄入风险商；采用累积暴露量的P99.9 值与相应指示化合物的ARfD 值进行比较，按式(5)计算急性膳食摄入风险商。根据JMPR[24]的相关报告可知，慢性毒性指示化合物苯醚甲环唑的ADI 值为0.01 mg/kg (bw)/d，基于肝毒性的慢性影响；急性毒性指示化合物氟硅唑的ARfD 值为0.02 mg/kg (bw)/d，基于诱发骨骼变异的急性影响。

风险评估结果见表8。可以看出，不论慢性还是急性风险，风险最高的都是对0 ～ 35 个月大的婴幼儿，其 %ADI 最高为34.6%，%ARfD 最高为51.7%，均处于安全范围内，但是仍需加强监控，降低蔬菜中残留的三唑类杀菌剂对婴幼儿的膳食暴露水平。

表8 蔬菜中残留的三唑类杀菌剂对不同人群的急性及慢性膳食摄入风险Table 8 Risk quotients of acute and chronic dietary intake of triazole pesticide residues in vegetables to different populations

2.3 不确定性分析

本研究的风险评估结果存在一定的不确定性。1) 大多数农产品一般都需经过清洗、加工或烹饪后食用，本研究膳食暴露量计算中对清洗、加工或烹饪过程中的农药残留损失未加以考虑，即未考虑加工因子这一因素，因此可能导致高估风险。2) 本研究仅对部分蔬菜中的三唑类杀菌剂残留进行了评估，未考虑其他食品及农产品中三唑类杀菌剂残留对风险的影响，也未考虑其他暴露途径 (如呼吸暴露等) 的影响，因此可能导致低估风险。3) 缺少精确的膳食调查数据，仅根据JMPR关于中国不同年龄段人群对各种食物的消费量调查数据进行评估，使得结果具有一定的不确定性。上述不确定因素可能导致风险被低估，也可能被高估，相互之间虽然会形成部分偏差抵消，但更为精确的评估还需要依赖更多残留和膳食等方面数据的积累，使风险评估的结果更接近于真实情况。

3 讨论与结论

由于受现有数据的局限，本研究未能将所有食物中的三唑类杀菌剂残留都考虑在内，但是根据对部分蔬菜的膳食暴露量计算可以看出，其暴露量是一个累加性的问题，对于未能考虑到的蔬菜，农药残留的膳食暴露量及其风险也会相应的减少，本研究做出的风险评估仅针对于上述种类的蔬菜。本研究结果表明，在所有批次蔬菜样本中，同时检出2 种及2 种以上三唑类杀菌剂的样本占4.8%，其中2 种三唑类杀菌剂同时检出的情况最为频繁(79%)。虽然同时检出3 种及3 种以上三唑类杀菌剂的几率较低，但是这种低几率的情况同样也不能忽视，由于本文采用概率性评估，同时存在3 种及3 种以上三唑类杀菌剂这种低几率的情况会量化在Monte Carlo 模拟中，从而对结果产生一定影响。

由于本研究所评估的8 种三唑类杀菌剂具有相同的急性和慢性毒性作用终点，因此会产生累积性暴露风险。采用相对效能因子法，分别以氟硅唑和苯醚甲环唑作为急性及慢性暴露的指示化合物，将样品中其他三唑类杀菌剂转化为指示化合物的当量浓度进行累加，计算出蔬菜中残留三唑类杀菌剂的累积当量浓度。根据累积当量浓度，采用概率评估方法，通过Monte Carlo 模拟得到暴露量的分布以及高百分位点值，定量描述了暴露量的变异性；通过Bootstrap 抽样方法得到高百分位点的置信区间，定量描述了抽样的不确定性。风险评估结果表明，蔬菜中残留的三唑类杀菌剂对不同人群的急性和慢性膳食摄入风险均处在可接受范围内，但对婴幼儿的风险较高，因此还需加强对三唑类杀菌剂在蔬菜中施用，特别是在黄瓜、韭菜和西红柿上施用的监管。