火龙果枝条角质改善壳聚糖膜性能的研究

庄远红, 郭祉婷, 费 鹏

（闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州363000）

传统保鲜膜可以减缓食品水分流失，避免外界接触污染，但难降解、机械性能低、抑菌性能不强.随着消费者对食品保藏要求的提高以及对环境保护意识的提升，由天然性可降解的、具有抑菌功能的生物材料制作而成的包装膜成为学者的热门研究点.壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，是天然多糖中唯一的碱性氨基多糖，具有较好的生物相容性、成膜性、抑菌性、可降解性等优点[1-4].但是单一的壳聚糖膜具有保湿性低、机械性能不佳、抑菌范围窄、抗氧化作用不高等缺点[5].角质是植物地上器官（如茎、叶等）表面的一层脂肪性物质，由C16和C18共价形成的聚酯，是植物角质层的重要成分，角质层是覆盖于植物表面的一层疏水性结构，可以平衡植物内部膨胀压、防止植物体内水分过分散失、抵御生物和非生物胁迫等[6-8].火龙果枝条表层覆盖较厚的角质层，火龙果枝条角质是否能够增强壳聚糖膜相关性能？实验从火龙果枝条提取角质，添加到壳聚糖中混合制膜，研究角质添加对壳聚糖膜微观结构、机械性能、透气性、透油性、透光性、抑菌性等的影响，以期为改善壳聚糖膜物理、力学、抑菌等性能提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火龙果枝条（采自闽南师范大学植物园）、壳聚糖（脱乙酰度≥95%，黏度50~200 mPa·s，浙江金壳生物化学有限公司）等.

1.2 仪器设备

MultiSkan Go 全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific 公司）；CT3-10K 质构仪（美国Brookfield 公司）；EL20K 台式pH 计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；NICOLET-iS-10 傅立叶变换衰减全反射红外光谱仪（ATR-FTIR）（美国赛默飞世尔公司）；Rigaku UltimalV X 射线衍射仪（日本Rigaku 株式会社）；JSM-6010LA扫描电子显微镜（日本电子株式会社）等.

1.3 实验方法

1.3.1 角质提取

火龙果枝条去刺，切段，速冻后真空冷冻干燥，粉碎后，按照Cigognini[9]的方法，火龙果枝条粉末以料液比1︰15浸泡至3%NaOH 溶液（pH14）中，121 ℃热压处理120 min，冷却后4 000 r/min离心30 min，上清液用6 mol/L HCI溶液调节pH 至5~6以沉淀角质，离心15 min，蒸馏水洗涤沉淀2 次，离心，真空冷冻干燥后即为干燥角质.

1.3.2 膜的制备

根据郑科旺等[10]的方法，将1.5 g壳聚糖溶解于90 mL 2.0%乙酸溶液中，将一定质量角质溶于10 mL 3%NaOH溶液中，两者混合之后磁力搅拌1.5 h，加入1%甘油后继续搅拌30 min，取20 mL至培养皿中流延，45 ℃烘箱干燥5 h，揭膜并置于6%NaOH 溶液中浸泡3 h，取出后用温水冲洗至中性，最后45 ℃干燥1 h，获得角质与壳聚糖比例分别为0︰15、2︰15、3︰15、4︰15、5︰15、6︰15的角质-壳聚糖膜.

1.3.3 微观形貌、特征基团及结晶性

选择角质与壳聚糖配比为0︰15 和3︰15 的膜，通过扫描电子显微镜观察膜的微观形貌（加速电压10 kV）；通过ATR-FTIR 确定膜的特征基团（波数范围4 000~500 cm-1，分辨率4 cm-1）；通过X-射线衍射仪确定膜的结晶特性（Cu靶Kα1射线，电压40 kV，电流40 mA，2θ范围：5°~80°，步长0.02°/min）.

1.3.4 膜物理性能测定

膜厚度：随机选取膜上5个点用游标卡尺测量，取平均值.

透光性：将待测样品切成直径6 mm 的圆片，置于酶标孔底部，在400~800 nm 下进行波长扫描，选取最适波长再测量吸光度，按下式计算膜的透光率：

其中：T为透光率；A为吸光度.

水蒸气透过系数及吸湿性：对GB1037-2000 方法改进，采用拟杯子法：向离心管中放入无水CaCl2粉末，加入量距离管口5 mm 处为止，称重；将膜剪成20 mm×20 mm 的正方形，称重并量其厚度，用膜将试管封口，用橡皮筋和棉线绑紧，倒置放于室温下底部为饱和盐水的密封干燥器内，使膜内外两侧保持一定蒸汽压差，每24 h取出离心管，同时将膜卸下，称取渗透后离心管和CaCl2合重、吸湿后膜的质量，至恒重，按下式计算水蒸气透过系数和吸湿率：

其中：WVP/g•mm•(m2•H•Pa)-1为水蒸气透过系数；Δm/g为氯化钙质量增加量；S/m2为膜封口的面积；Δt/h为测定间隔时间；d/mm 为膜的厚度；Δp/Pa 为膜两侧的水蒸气压差；MAR 为吸湿率；m1/g 为膜的初始质量；m2/g为吸湿后膜的质量.

透油性：将3 mL 调和油倒入试管中，用膜封口，并用橡皮筋和棉线绑紧，倒置于称量好的滤纸上，放置5 d后对滤纸进行称重，按下式计算膜的透油系数：

其中：P/(g•mm/(m2•d))为透油系数；Δm/g 为滤纸的增重；d/mm 为膜的厚度；S/m2为封口处膜的面积；t/d 为透油时间.

1.3.5 膜机械性能测定

使用切膜工具，将膜切成4 mm×50 mm 统一大小，测量膜厚度，使用质构仪TA-DGF 双向拉伸夹具进行拉伸测试，触发力0.01 N，测试速度为1.00 mm/s，记录膜断裂时的长度和拉伸力，反复3 次，计算抗拉强度和断裂伸长率：

其中：TS/MPa 为膜的抗拉强度；F/N 为轴向拉伸力；W/mm 为膜的宽度；d/mm 为膜的厚度；EAB 为断裂伸长率；L/mm为膜断裂时的长度；L0/mm为膜的初始长度.

1.3.6 抗菌性

采用液体培养法测定角质添加对测试菌种（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌）的抑菌效果：在无菌条件下将测试菌种分别接种于肉汤培养基中，于37 ℃以200 r/min振荡培养24 h，使菌种进入稳定的对数生长期，用无菌水稀释，继续振荡培养12 h 后测定OD 值达到0.5 即为菌悬液.将膜切割成直径为6 mm 的小圆片，在无菌工作台上取1 mL 菌悬液加入9 mL 的肉汤培养基里面，再放入7 片小圆片，于37 ℃以200 r/min振荡培养24 h，测菌悬液OD值.每个菌种3次重复，同时做空白对照.

2 结果与分析

2.1 角质对壳聚糖膜微观形貌、特征基团及结晶特性的影响

2.1.1 X射线衍射分析

图1 分别为角质:壳聚糖为0︰15 和3︰15 的复合膜X 射线衍射图.由图1 可知，壳聚糖膜（0︰15）有2 个明显的结晶峰，衍射角分别为5.86°和20.8°.壳聚糖是直链型大分子结构，分子排布较为有序，有许多羟基、氨基等物质，可以形成氢键，部分分子形成结晶区[11-12].添加角质的壳聚糖膜（3︰15）结晶峰分别在2θ等于5.94°、20.16°，壳聚糖结晶峰稍有减弱，这可能是由于角质分子掺入到壳聚糖中，阻碍了其分子的重排结晶.

图1 角质-壳聚糖复合膜X射线衍射图Fig.1 X-ray diffraction pattern of cutin-chitosan composite membrane

2.1.2 红外光谱分析

由图2 可知，0︰15 处理的壳聚糖膜中3 247.54 cm-1处较宽的吸收峰为O-H 和N-H 伸缩振动叠加的多重吸收峰，这是因为壳聚糖与乙酸混合制成的膜液使氨基带正电荷形成了NH3+，膜液中大量的-OH 和H+很容易缔合，形成分子内和分子间的氢键，由于氢键作用强弱和键长不同，使得吸收峰频率范围较大，因此该处吸收峰的峰型较宽[14].2 875.34 cm-1处出现了一个较弱吸收峰，这是C-H 的伸缩振动引起的，1 542.77 cm-1处出现了一个峰型狭窄的峰是羰基C=O 伸缩振动引起的，1 409.71 cm-1处则是N-H 弯曲振动所形成的，1 024.02 cm-1是C-O-C 的对称伸缩引起的，921.81、646.04 cm-1处的峰则来自于C-H 面弯曲振动.当壳聚糖与角质复合时，如图2 中的3︰15 处理可知，物质间的波谱峰型发生了变化，3 247.54 cm-1处的伸缩振动峰移动到了3 261.04 cm-1，这是由于壳聚糖中的氨基上的H+与角质的OH-形成了氢键所致[11]；2 875.34 cm-1C-H 伸缩振动峰向高波移动到了2 917.77 cm-1，这是由于角质中C-H 键的振动吸收；1 542.77 cm-1移动到了1 548.56 cm-1是由于角质中的C=C共轭双键的振动吸收.

图2 角质-壳聚糖复合膜红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of cutin-chitosan composite membrane

2.1.3 扫描电镜分析

从图3 可以看出，未添加角质的壳聚糖膜（0︰15）表面质地光滑，但膜面干燥后有凹凸感[13]；而加入角质后，角质-壳聚糖复合膜（3︰15）表面粗糙、颗粒感明显，但角质分散均匀，角质中柔性分子链的填充增强了壳聚糖的空间网络结构[7]，使得复合膜变得更加致密.

图3 角质-壳聚糖复合膜电镜分析Fig.3 Electron microscopic analysis of cutin-chitosan composite membrane

2.2 角质对壳聚糖膜物理性能的影响

2.2.1 膜厚度

由图4可以看出，随着角质添加量的增加，复合膜的厚度显著增加，未添加角质的壳聚糖膜厚度最小，仅0.072 mm，而6︰15 的角质-壳聚糖复合膜厚度可达0.114 mm，表明角质的添加对膜厚度影响较大，这可能是因为角质作为填充物进入壳聚糖大分子中，两者通过氢键紧密相连，增强了壳聚糖分子链的网络结构[12]，角质添加量越大，网络结构越牢固，膜厚度越大.

图4 角质对壳聚糖膜厚度的影响Fig.4 The effect of cutin on the thickness of chitosan membrane

2.2.2 透光率

从图5可以看出，角质-壳聚糖复合膜吸光值在420、635、660 nm附近处有峰值，由图6可以看出，随着角质添加量的增加，各波长下复合膜的透光率呈下降趋势，表明角质的添加降低了膜的透光性，这可能是角质填充在壳聚糖分子间，引起了透光率的降低，透光性低可以保护光敏性物质不因光的照射而分解.

图5 角质-壳聚糖复合膜的波长扫描图Fig.5 Scanning wavelength of cutin-chitosan composite membrane

图6 角质对壳聚糖膜透光率的影响Fig.6 Effect of cuticle on the transmittance of chitosan film

2.2.3 水蒸气透过系数及吸湿性

由图7 可以看出，角质降低了壳聚糖膜的水蒸气透过系数，随着角质添加量的提高，复合膜的水蒸气透过系数随之降低，当角质与壳聚糖配比为3︰15 时，水蒸气透过系数趋于稳定.这主要是因为添加角质后，角质-壳聚糖网络结构牢固，水蒸气透过膜空隙的有效路径延长[11]，并且角质具有疏水基团[15]，能阻挡水蒸气的透过，所以水蒸气透过系数随着角质的添加量增加而降低，当角质添加达到一定量时，能够最大限度阻止水蒸气的进入，此时水蒸气透过系数趋于稳定.当水蒸气无法透过复合膜时，将会聚集在膜表面，使膜的吸湿性增强，所以由图7还可以看出，随着角质添加量的增加，吸湿率显著增大，并趋于饱和.

图7 角质对壳聚糖膜水蒸气透过系数及吸湿率的影响Fig.7 Effect of cutin on water vapor transmission coefficient and moisture absorption rate of chitosan membrane

2.2.4 透油性

由图8可以看出，随着角质添加量的增加，角质-壳聚糖膜的透油系数显著降低（p<0.05），这主要是因为两者间致密的网络结构也阻挡了油的透过，故随着角质添加量的增加，透油系数下降.

图8 角质对壳聚糖膜透油系数的影响Fig.8 The effect of cutin on the oil permeability coefficient of chitosan membrane

2.3 角质对壳聚糖膜机械性能的影响

由图9 可以看出，随着角质添加量的提高，壳聚糖膜的断裂伸长率和抗拉强度均迅速增大，当角质与壳聚糖配比增大到4︰15后，抗拉强度和断裂伸长率趋于稳定.这是由于壳聚糖中的氨基上的H+与角质的OH-形成了氢键[11]，因此在受到外力作用时，力学性能得到改善.

图9 角质对壳聚糖膜抗拉强度和断裂伸长率的影响Fig.9 The effect of cutin on the tensile strength and elongation at break of chitosan film

2.4 角质对壳聚糖膜抗菌性的影响

从图10可以看出，角质与壳聚糖的配比为0︰15时，即单一的壳聚糖膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用较差，抑制率仅为8%左右，但随着角质添加量的增加，角质-壳聚糖膜对3 种菌的抑制率均显著增大，说明添加角质提高了壳聚糖膜的抑菌性能.其中角质-壳聚糖膜对金黄色葡萄球菌的抑制效果好于大肠杆菌和白色念珠菌，对大肠杆菌和白色念珠菌的抑制效果差别不大.角质对3 种菌的抑制机理还不清楚，但Alcerito等[16]从二叶藤属叶的表皮蜡质中提炼出4种黄酮类抗真菌成分，Wang等[17]研究发现缺少蜡质层的番茄比蜡质层含量丰富的番茄叶表着生更多的菌物，这些都说明了角质具有抗菌或抑菌功效.

图10 角质对壳聚糖膜抑菌率的影响Fig.10 The effect of cutin on the antibacterial rate of chitosan membrane

3 结论

角质的添加增强了壳聚糖与角质之间的物理交联，增强了壳聚糖膜的空间网络结构，提高了膜的致密性，明显改善壳聚糖膜的物理、力学和抑菌性能.角质-壳聚糖膜透光率降低，可保护光敏性物质的分解；水蒸气透过系数降低，吸湿率增大，透油系数降低，可提高对食品的保鲜效果；抗拉强度和断裂伸长率增大，机械性能增强；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用增强，抑菌效果提高.