体外模型研究制川乌和白芍配伍中重金属铅和镉毒性

林路秀, 郑静茵

（1.闽南师范大学化学化工与环境学院,福建漳州363000；2.福建省现代分离分析科学与技术重点实验室,福建漳州363000；3.福建省污染监测与控制省高校重点实验室,福建漳州363000）

中草药中重金属及有害元素污染对人类健康的影响越来越受到人们重视[1-2]，重金属污染是影响中药品质和推广使用的关键因素.当人们食用受重金属污染的食品或药品，体内重金属含量达到一定程度时，会使组织器官发生病变，导致各种疾病的发生，影响人类健康[3].例如高浓度的铅和镉会削弱机体免疫力，破坏生育力，造成肾损伤[4].川乌为毛茛科多年生草本植物乌头的块根，白芍为毛茛科多年生草本植物白芍的根，川乌与白芍是中医治疗风湿痹证的传统寒热药对.

目前，川乌和白芍配伍研究大多集中在乌头碱和芍药苷等有机成分上[5-7]，对重金属污染等安全问题的研究报道较为少见[8].应用体外胃肠仿生模型对食品药品中重金属毒性研究已有大量报道[9-11]，与大鼠等动物实验模型相比，体外仿生模型更简便、易行，但已有仿生模型大部分只模拟胃或小肠部位的消化和吸收，较少模拟大肠和肠道微生物的作用[12-13].本文建立体外全消化道(口腔、胃、小肠和大肠)仿生-微生物代谢模型研究川乌和白芍单煎液及不同配伍水煎液中重金属铅和镉的毒性，为川乌和白芍生产和使用风险评估提供一定参考.

1 实验部分

1.1 仪器

Agilent 7500cx 系列ICP-MS (美国安捷伦公司)；MK-III 微波消解仪(上海新仪微波化学科技有限公司)；FR224CN 分析天平(美国奥豪斯)；梅特勒FE28 台式pH 计(梅特勒-托利多)；DHG-9240A 电热鼓风干燥箱(上海培因实验仪器有限公司)；SHA-C 水浴恒温振荡器(常州市亿能实验仪器厂)；N-1300D 型旋转蒸发器(东京理化EYELA)；LDZX-50KBS 高压灭菌锅(上海申安)；BUGBOX-SM 厌氧培养箱(英国Ruskin 科技有限公司)；DFT-50A 手提式万能高速粉碎机(上海比朗仪器有限公司)；DW-86L390Y 超低温冰箱(青岛澳柯玛超低温冷冻设备有限公司)；Millipore Mill-Q 超纯水机(美国，Millipore公司).

1.2 材料与方法

制川乌和白芍购买于漳州市老瑞林药店，经漳州市卫生职业技术学院中药学专家谢伟容实验师鉴定.杨树叶国家标准物质：GBW07604(GSV-3)，购买于标准物质中心网(www.bwsm.org)；100 mg·L-1Pb 和Cd单元素标准溶液购于国家标准物质研究中心，逐级稀释法配制浓度分别为：0,10,20,50,100和200μg·L-1标准溶液；100 mg·L-1的45Sc, 72Ge, 103Rh, 115In, 209Bi 内标溶液稀释成500μg·L-1浓度使用；10μg·L-1的7Li, 89Y, 140Ce, 204Tl, 59Co 调谐溶液稀释成1μg·L-1浓度使用，上述溶液均用5%硝酸溶液稀释.69%~70%浓硝酸(优级纯，德国默克公司)、30%过氧化氢(优级纯)；浓盐酸(优级纯)；磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫氰酸钾、磷酸钠、氯化钙、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化铵、氯化镁、氢氧化钠、葡萄糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、PBS缓冲液、盐酸半胱氨酸、酵母抽提物、琼脂、尿素、尿酸、粘蛋白、牛血清蛋白购于上海国药集团化学试剂中国公司；α-淀粉酶(>1 000 U/mg)、胃蛋白酶(>250 U/mg)、胰蛋白酶(>2 000 U/mg)、脂肪酶(>200单位/mg)、胆汁购于美国西格玛公司、δ-纤维素酶(>50 U/mg)、δ-木聚糖酶(>2 500 U/mg)、β-葡聚糖酶(>50单位/mg)、δ-果胶酶(>500 U/mg)购于上海源叶生物科技有限公司，以上试剂均为分析纯.实验所需的所有容器洗净后，10%硝酸浸泡48 h，最后用超纯水冲洗干净.

1.3 制川乌和白芍单味药水煎剂及不同配伍水煎剂的制备

制川乌是中药川乌炮制加工品，制川乌和白芍中药洗净后，于80 ℃烘箱中恒温烘干至恒重，备用.根据《中医方剂大辞典》记载的川乌(A)与白芍(B)配伍方剂208 首中配伍比例1A︰1B 占59.96%，1A︰2B，2A︰1B 和2A︰3B 共占15.29%[14]，因此本研究将配伍比例设定为1A︰1B，1A︰2B 和2A︰1B，同时与制川乌和白芍单味药进行对照.

制川乌单煎液：称取制川乌20.0 g，加水10倍量，浸泡30 min，加热至沸腾，保持微沸约1 h，煎煮3次，每次加超纯水200 mL，合并3次煎煮液，趁热过滤，加热浓缩，定容至250 mL，于4 ℃下保存备用.白芍单煎液，称取白芍20.0 g；制川乌白芍1︰1配伍水煎液，称取制川乌20.0 g，白芍20.0 g；制川乌白芍1︰2配伍水煎液，称取制川乌20.0 g，白芍40.0 g；制川乌白芍2︰1 配伍水煎液，称取制川乌40.0 g，白芍20.0 g；白芍单煎液及制川乌和白芍不同配伍(1A︰1B，1A︰2B 和2A︰1B)水煎液煎煮及浓缩方法同制川乌单煎液的制备.

1.4 口腔、胃、小肠、胆汁和大肠仿生消化液的制备

口腔、胃、小肠、胆汁和大肠仿生消化液的制备参考文献[12-13,15]，即根据人体消化部位，加入对应消化器官含有的无机物、有机物、生物酶，调节pH值.

1.5 大肠微生物菌液接种和培养

人体大肠微生物菌群的接种和体外培养参考文献[16-17]：从三位身体健康志愿者(在过去一年内未食用抗生素类药物)，收集新鲜粪便，等量混合后加入磷酸盐缓冲溶液中(0.1 mol/L)，匀浆5 min，静置10 min，取5 mL上清液以10 000 r/min离心10 min,上层菌液用于接种实验用.

参考文献[16]制备肠道微生物培养液：称取3.0 g 酵母，3.0 g 胰蛋白，3.0 g 葡萄糖，0.05 g 硫代硫酸钠，0.5 g 盐酸半胱氨酸，0.1 g 磷酸氢钾，蒸馏水1 000 mL，混合，调节pH=6.6~6.9，培养液于121 ℃高压灭菌锅中灭菌30 min，37 ℃恒温箱保存备用.以1︰10 的比例将上层菌液接种，即取100 mL 上层菌液，接种至1 000 mL 培养液中，充氮气，将培养液放入37 ℃恒温厌氧培养箱中培养48 h，获得稳定纯化肠道微生物菌落.微生物接种和培养所用仪器均在121 ℃高压灭菌锅中灭菌30 min，操作过程于37 ℃无氧超洁净工作台上.

1.6 制川乌和白芍单煎液及其配伍水煎液胃肠仿生消化及微生物代谢

参考文献[18]制备胃、肠仿生消化和微生物代谢食靡：第一组，分别取50 mL制川乌和白芍单煎液、配伍水煎液，分别加入5 mL唾液，恒温(37 ℃)振荡5 min，分别加入30 mL胃液，再恒温(37 ℃)振荡2 h，得胃消化食靡；第二组，分别取单煎液和配伍水煎液50 mL，胃仿生消化后(方法同胃消化食靡制备)，继续分别加入30 mL 十二指肠液和15 mL 胆汁，恒温(37 ℃)振荡7 h，得小肠消化食靡；第三组，分别取单煎液和配伍水煎液50 mL，小肠消化后分别加入30 mL 大肠消化液和15 mL 经稳定纯化的肠道微生物菌液，充氮气，于37 ℃厌氧培养箱中培养18 h，得大肠消化和微生物代谢食靡.在相同方法下用超纯水代替仿生消化液做空白实验.胃肠仿生消化及微生物代谢食靡于-80 ℃下保存待用.

1.7 样品中铅和镉测定

制川乌和白芍药粉预处理：样品粉碎，分别精密称取0.5 g制川乌和白芍药粉，分别放入消解罐中，分别加入8.0 mL 浓硝酸和4.0 mL 过氧化氢，于80 ℃水浴中处理约20 min，待黄烟散尽，补加4.0 mL 浓硝酸和2.0 mL过氧化氢，按操作规程安装好装置，消解10 min，冷却，消解液定容至25 mL；制川乌和白芍单煎液及配伍水煎液、仿生消化食靡预处理：分别取5 mL 水煎液、仿生消化食糜，分别加入消解罐中，分别加4.0 mL 浓硝酸和2.0 mL 过氧化氢，消解10 min，冷却，消解液定容至25 mL，同法同时做空白试验.ICP-MS法测定药粉、水煎液、胃肠仿生消化和微生物代谢食糜中铅和镉含量.

2 结果与讨论

2.1 Pb和Cd元素测定的准确度分析

杨树叶标准物质中Pb和Cd元素的鉴定值和测定值见表1，重金属Pb和Cd的测定结果均在鉴定值范围内，且Pb 和Cd 元素的相对标准偏差(RSD)在3.8%以内.结果表明分析方法准确，符合Pb 和Cd 测定要求，可用于制川乌和白芍药粉、水煎液及其仿生消化食靡中Pb和Cd的测定.

表1 杨树叶(GBW07604)标准物质中Pb和Cd元素的测定Tab.1 Determination of lead and cadmium in poplar leaves(GBW07604)(n=3)

2.2 制川乌和白芍样品及其配伍水煎液中重金属Pb和Cd含量

制川乌和白芍样品及其不同配伍水煎液中重金属Pb 和Cd 含量见表2.根据《中华人民共和国药典》2015年版规定草药中Pb和Cd的标准限值分别为5 mg/kg和1 mg/kg[19].从检测结果来看，制川乌药粉中重金属Pb 为2.88 mg/kg，Cd 为0.53 mg/kg，白芍药粉中Pb 为2.01 mg/kg，Cd 为0.10 mg/kg，均低于国家现行标准.制川乌和白芍单味药及其配伍水煎液中Pb 元素含量≤0.81 mg/kg，Cd 元素含量≤0.07 mg/kg，Pb和Cd 元素溶出率都较低(4.3%～21%)，制川乌和白芍药材经过煎煮后重金属Pb 和Cd 小部分溶出(≤21%)，水煎液中重金属含量降低，比较摄入制川乌和白芍颗粒剂，人体摄入水煎剂方式重金属含量降低，其毒性也不同[13].

2.3 制川乌和白芍单煎液及其配伍水煎液胃肠仿生消化及肠道微生物代谢食靡中Pb和Cd含量

制川乌和白芍单煎液及配伍水煎液胃肠仿生消化及肠道微生物代谢食靡中Pb 和Cd 含量见表3 所示.制川乌和白芍单味药及其配伍水煎液中Pb 元素含量≤0.81 mg/kg，Cd 元素含量≤0.09 mg/kg.制川乌和白芍单味药及其配伍水煎液经过胃仿生消化后，食靡中Pb元素含量≤0.17 mg/kg，Cd元素含量≤素含量g mg/kg；小肠仿生消化后，小肠仿生消化食靡中Pb元素含量≤素含06 mg/kg，Cd元素含量≤素含量32 mg/kg,Cd元素只有川乌单味药水煎液测出，其他均未测出；大肠仿生消化和微生物代谢食靡中，除制川乌和白芍单味药水煎液食靡中测出微量的Pb 元素，其他配伍水煎液大肠消化和微生物代谢食靡中Pb 元素含量低于仪器检出限，未测出；Cd元素也低于仪器检出限，均未测出.

表3 制川乌(A)和白芍(B)单煎液及其配伍水煎液、胃肠仿生消化和肠道微生物代谢食靡中铅和镉含量(n=3)Tab.3 Contents of Pb and Cd in single and different combinations of decoction of Aconitum carmichaeli Debx.(A)and Paeonia lactiflora Pall.(B)from bionic gastrointestinal digestive and intestinal microbial metabolism chyme(n=3).

由表中变化趋势看，经过胃消化后食靡中Pb 和Cd 浓度略微降低，进一步经过小肠消化，小肠消化食靡中Pb和Cd浓度再次降低，而大肠消化和微生物代谢食靡中Pb和Cd浓度仪器基本检测不出，中草药中重金属释放、迁移和转化受胃肠酸度、消化酶、肠道菌群和药草中有机成份的影响.进入胃肠消化道后，经过消化液消化和微生物代谢，重金属被消化液稀释导致浓度降低，同时与消化液中有机或无机成分发生反应，其形态发生变化，毒性也发生相应变化.

3 结论

水煎剂是中草药最常用的服用方法，中草药中有效成分煎出的同时，有毒成分(如重金属)也会煎出，中草药水煎液中重金属进入胃肠消化道后经过消化液消化和微生物代谢，重金属也将与消化液中有机或无机成分发生反应，其形态发生变化，毒性也发生相应变化.目前，2015 年版《中华人民共和国药典》规定草药中的Pb和Cd最大残留限量分别为5 mg/kg和1 mg/kg.从检测结果来看，制川乌和白芍药粉中重金属Pb和Cd的含量均低于国家现行标准，而制川乌和白芍单煎液及其配伍水煎液中Pb元素含量≤0.81 mg/kg，Cd 元素含量≤0.07 mg/kg，Pb 和Cd 元素溶出率≤21%，远远小于2015 年版《中华人民共和国药典》规定草药中的Pb 和Cd 最大残留限量，由此表明我国居民在饮用含制川乌和白芍中草药方剂时Pb 和Cd 暴露水平很低.