巨尾桉精油及主要化合物对黄瓜种子萌发的影响

唐凤鸾，陈月圆，李典鹏，赵 健

(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所/广西植物功能物质研究与利用重点实验室，广西 桂林 541006)

桉树原产于澳大利亚，是一种速生工业用材树种。由于其生长速度快、适应性广、经济效益好，被引种到世界各地。然而，过量种植桉树已造成了一系列生态问题，如生物多样性下降[1-2]、土壤退化[3]、对本地物种的化感作用[4]等。化感物质是植物产生和积累的次生代谢物，几乎存在于所有植物物种组织中[5-9]。植物通过释放化感物质调节其附近的土壤微生物群落、影响草食动物、改变周围环境的化学和物理性质，或直接抑制种子萌发、生长和竞争性植物物种的发育[10-11]。

桉树能释放大量挥发性化合物，这些物质一部分被土壤颗粒吸附或溶解在水中[12]，其中部分化合物通过根系吸收对其他物种造成伤害，从而影响植物生长[13-14]。如柠檬桉挥发物对杂草和农作物的生长具有化感作用，刚果12号桉挥发物对中国本土豆科草本植物具有抑制作用[15]，尾叶桉挥发物对金合欢和合欢幼苗生长有明显抑制作用[16]。尽管现有文献对桉树叶片总挥发物的化感作用进行了较广泛的研究，但很少涉及挥发物中单体化合物的化感作用。事实上，挥发物的某些成分可明显抑制或刺激其他物种的种子萌发和胚根伸长[17-18]。本研究采用气相色谱-质谱联用技术对广西主要人工林巨尾桉的叶片精油进行分析，并进一步探讨精油及主要化合物对黄瓜种子萌发及胚根生长的影响，旨在评估人工桉树林对周边地区黄瓜生产的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

在广西国有黄冕林场，选取四年生巨尾桉(Eucalyptusgrandis×E.urophylla)人工林为采样基地，将其分为东、南、西、北、中等5个部分。于2019年5月，在每个部分随机选取10棵长势均匀、无病虫危害的巨尾桉树，将每棵树的树冠分为上、中、下三层，分别从每一层的东、南、西、北4个方向收集5个当年生粗壮枝条，带回实验室后，摘取每条枝条的第6～15片成熟功能叶(从顶端开始数)，擦洗干净，备用。

黄瓜(CucumissativusLinn)种子为山东省新泰市强大种业有限公司生产的油亮3-8 F1品种。发芽试验前，种子先用0.1%高锰酸钾溶液浸泡30 min进行表面消毒。

1.2 精油提取及分析

将采集的巨尾桉新鲜叶片切成约2 cm大小的碎片，取适量叶片置于圆底烧瓶内加入蒸馏水，用挥发油提取器按常规水蒸气蒸馏法加热微沸4 h，得到油状物经分液漏斗用正己烷萃取分离，无水硫酸钠干燥24 h，分离得到淡黄色精油，在4 ℃下保存。然后在所得精油中加入适量正己烷溶解，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液用于气相色谱-质谱联用技术分析。

使用7890 A/5975 C型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司生产)对精油进行分析。色谱条件为：HP-5 MS 5% Phenyl-Methyl Siloxane(30 m × 250 μm × 0.25 μm)弹性石英毛细管柱；柱温设定为以3 ℃·min-1的速度由60 ℃升至120 ℃，然后再以5 ℃·min-1的速度升至250 ℃；气化室温度为250 ℃；FID检测器加热器250 ℃,载气为体积分数99.999%的高纯氦气，载气流量为1.0 mL·min-1；进样方式为GC自动进样器，进样量为1.0 μL，分流比为30∶1。质谱条件：离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV，MS四级杆温度为150 ℃，接口温度280 ℃。

检测结果与Agilent NIST 05 a数据库中化合物的质谱进行比较，确定巨尾桉精油中的化合物，并在色谱条件下用C 6-C 28标准混合物计算样品的保留指数(RI)。分析3次，计算各成分的相对百分比为平均值。

1.3 生物检测方法

以黄瓜为测试植物，通过检测种子萌发及胚根生长，研究巨尾桉精油及含量达1%的主要化合物的化感作用。

在培养皿(直径90 mm)底部垫5层滤纸(用于吸水以保持湿度)，将灭菌后的黄瓜种子均匀置于培养皿上，每个培养皿中加入7 mL待测溶液(精油或已知浓度的化合物)，以蒸馏水作为对照。其中水溶性低的化合物溶解于水∶丙酮比为97∶3的混合物中(单独使用这种混合物与单独用水的对照组相比没有表现出明显差异)。培养皿放置于温度为(25±1)℃，相对湿度为70%，连续光照20 μmol·(m2·s)-1或黑暗的培养箱中培养。每个处理重复5次，每个培养皿播20粒种子。在培养皿中直接观察种子萌发情况，每12 h观察一次，以胚根突破种皮为萌发标准统计萌发率，5 d后测定胚根长度。

用于测试的纯化合物购自日本东京TCI公司。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel软件和SPSS 16.0软件处理分析。

2 结果与分析

2.1 巨尾桉精油分析结果

利用气相色谱-质谱联用技术对巨尾桉精油成份进行分析，结果鉴定出52种化合物，具体见表1。其中相对含量较高的化合物有1,8-桉叶素(41.82%)、α-蒎烯 (39.54%)，占总含量的81.36%，为巨尾桉精油的主要成分。根据化合物的结构特点将精油成分分为五类，第一类为含氧单萜类化合物(57.40%)，含量最高的为1,8-桉叶素(41.82%)，其次为α-松油醇乙酸萜烯(6.17%)，α-松油醇(4.33%)和2-茨醇(1.57%)；第二类为单萜烯类化合物(41.41%)，主要成分为α-蒎烯 (39.54%)；其他化合物仅占1.19%。

表1 巨尾桉精油化学成分Table 1 Chemical constituents of essential oil of E. urophydis

2.2 巨尾桉精油对黄瓜种子萌发及胚根生长的影响

在光照和黑暗条件下，浓度为10～300 μg·mL-1的巨尾桉精油处理黄瓜种子120 h后的结果见表2。精油对黄瓜种子萌发的抑制作用存在明显的剂量依赖，随使用浓度的增加而加强，且黑暗条件处理较光照条件更为明显；浓度为10～20 μg·mL-1时，光照条件下种子萌发率与对照无明显差异，但黑暗条件下萌发抑制率达12%～16%；浓度为150 μg·mL-1时严重抑制黄瓜种子萌发，抑制率达84%～88%。精油对黄瓜胚根生长的影响较大，在所有测试条件和浓度下均能完全抑制胚根生长。

表2 巨尾桉精油对黄瓜种子萌发和胚根生长的影响Table 2 Effects of E. urophydis essential oil on seed germination and radicle growth of cucumber

2.3 巨尾桉精油中主要化合物对黄瓜种子萌发及胚根生长的影响

在精油实验基础上，采用同样的生物检测法，对含量在1%以上的5个主要化合物进行化感作用测试。由表3可知，各测试化合物在光照和黑暗条件下对黄瓜种子萌发和胚根生长的影响效果无显著差异，这与精油实验中黑暗较光照条件抑制作用强的结果存在一定差异。测试化合物中，α-松油醇可完全抑制黄瓜种子萌发(抑制率100%)；α-松油醇乙酸萜烯和1,8-桉叶素的效果较接近，萌发抑制率在52%～68%之间，且能完全抑制胚根生长；α-蒎烯和2-茨醇对萌发的抑制效果不明显(6%～13%)，但α-蒎烯处理的种子胚根完全不能生长，而2-茨醇对胚根长生的抑制率分别为21%和40%。由此可见，巨尾桉精油主要化合物均能严重抑制黄瓜种子萌发或胚根生长。

表3 主要化合物对黄瓜种子萌发和胚根生长的影响Table 3 Effects of main compounds of E. urophydis essential oil on seed germination and radicle growth of cucumber

2.4 不同浓度化合物对黄瓜种子萌发及胚根生长的影响

选取抑制效果较强的3种化合物进行低浓度实验，结果见表4。发现浓度为50 μg·mL-1时，3种化合物均能极显著抑制黄瓜种子萌发，且完全抑制胚根生长。随着使用浓度的下降各化合物的抑制效果出现明显差异，当浓度为2 μg·mL-1和10 μg·mL-1时，α-松油醇乙酸萜烯对黄瓜种子萌发的影响很小，但能完全抑制胚根生长；10 μg·mL-1的1,8-桉叶素对光照条件下的种子萌发，及光照和黑暗条件下胚根生长的抑制效果显著，而2 μg·mL-1的影响不明显；10 μg·mL-1的α-松油醇能100%抑制黄瓜种子萌发，且浓度低至2 μg·mL-1时抑制率仍保持22%和32%，可见α-松油醇对黄瓜生产影响最大。

表4 低浓度α-松油醇乙酸萜烯、1,8-桉叶素和α-松油醇对黄瓜种子萌发和胚根生长的影响Table 4 Effects of low concentration α-terpinol terpene acetate, 1,8-cineole and α-terpinol on seed germination and radicle growth of cucumber

3 结论与讨论

巨尾桉精油共检出52种化合物，根据结构特点分为五大类，其主要成分1,8-桉叶素(41.82%)、α-蒎烯 (39.54%)、α-松油醇乙酸萜烯(6.17%)、α-松油醇(4.33%)和2-茨醇(1.57%)均属于含氧单萜类和单萜烯类化合物。前人已对多个桉树品种的叶片精油成分进行了分析，李奥欣等[19]报道，尾叶桉精油检出92种化合物，含量大于1%的有7种，其中最高的3种为1,8-桉油素(64.1%)、α-蒎烯(11.4%)、α-乙酸松油酯(7.9%)；柳桉叶挥发油检出42种化合物，含量大于1%的有8种，含量最高的3种为对伞花烃(24.45%)、α-蒎烯(16.53%)、1，8-桉叶油素(9.16%)[20]；窿缘桉叶精油检出24种化合物，含量大于1%的有11种，含量排前3的为1，8-桉叶素(38.82%)，α-蒎烯(13.52%)、对伞花烃(12.04%)[21]。通过对比发现，不同品种桉树叶精油的化合物数量、主成分种类及含量存在较大差异，但1,8-桉叶素、α-蒎烯作为含量最高的化合物出现在不同的品种中，成为桉树叶精油的共同特征。

巨尾桉精油在黑暗条件下对黄瓜种子萌发的抑制作用较光照强，而其主要化合物在光照和黑暗条件下的作用效果差异不明显。原因可能是精油中不同化合物对测试物种的抑制作用差异较大，且抑制作用与其在精油中的含量大小无直接关系。本研究中含量为4.33%的α-松油醇处理浓度为2 μg·mL-1时，在光照和黑暗条件下仍对黄瓜种子萌发保持22%和32%抑制率，而含量达39.54%的α-蒎烯处理浓度为100 μg·mL-1时，在光照和黑暗条件下的抑制率分别只有7%和13%，含量很低的化合物的抑制作用通过聚集最终成为影响其他物种生长发育的主要因素。此外，巨尾桉精油在光照和黑暗条件下的作用效果，还与芸香精油对萝卜种子萌发的抑制作用在光照条件下明显比黑暗条件下强[17]的结果存在较大差异，这可能是不同树种精油成分及受试物种特性差异所致。

α-蒎烯(39.54%)和1,8-桉叶素(41.82%)为巨尾桉精油中最主要的两个化合物，但其对黄瓜种子萌发和生长的影响差异较大，无论是在光照还是在黑暗条件下α-蒎烯的抑制作用均不明显，而1,8-桉叶素呈现出明显的剂量依赖性，抑制作用随使用浓度的下降而快速减弱。这与Saban等[22]报道的单萜烯对藜麦种子萌发无植物毒性作用，及含氧单萜化合物比单萜烯对种子萌发具有更强的抑制作用的结果一致。含氧单萜类化合物α-松油醇和α-松油醇乙酸萜烯均对黄瓜种子萌发和生长表现出了显著的抑制作用，尤其是α-松油醇，虽然其在精油中含量仅为4.33%，但它在所有被测试化合物中抑制作用最强，即使浓度降到2 μg·mL-1仍能严重抑制黄瓜种子萌发和生长。2-茨醇虽然也是一种含氧单萜化合物，但其抑制作用在所有测试化合物中最低，这与Despina等[23]报道的2-茨醇严重抑制农作物和杂草的种子萌发和植株生长的结果差异较大。可见，不同化合物的作用效果不仅与其自身的结构特点、化学性质有关，还与被作用的物种有关。

与种子萌发相比，巨尾桉精油及其主要化合物对胚根生长的抑制作用更为严重，α-松油醇和α-松油醇乙酸萜烯在极低浓度下(2 μg·mL-1)便能完全抑制黄瓜胚根伸长，而α-蒎烯、1,8-桉叶素和2-茨醇也表现出了较强的抑制作用。这与牧草的胚根长度对黑芥菜、紫花苜蓿提取物较种子萌发更敏感[24-25]，与Despina等[23]的结果相似。出现这一现象的原因可能是单萜烯类化合物亲脂性好，容易穿透线粒体膜，改变脱氢酶活性，从而损害呼吸代谢[26-27]；如1,8-桉叶素是一种有效的线粒体悬液吸氧抑制剂[28]，因此推测挥发油及其单萜类物质通过抑制根系呼吸作用从而影响黄瓜根系发育[29]。

研究结果显示，巨尾桉精油及其主要化合物对黄瓜种子萌发和胚根生长具有较强的化感作用，而这些精油或其化合物被土壤吸附转运后，其抑制活性可保持数月[30]，对林区及周边地区的农业发展造成一定制约，因此在巨尾桉生产区筛选不受其化感物质影响的物种具有重要意义。