透明质酸/N-异丙基丙烯酰胺复合水凝胶的制备及其性能

黄缘麟 李 娴,2 龙 泉 何珂雯 郭 超 魏湖波 叶 旭,2,3

(1. 西南科技大学材料科学与工程学院 四川绵阳 621010；2. 西南科技大学环境友好能源材料国家重点实验室 四川绵阳 621010； 3. 西南科技大学成人教育学院、网络教育学院 四川绵阳 621010)

透明质酸(HA)是动物细胞基质的主要成分，是一种天然高分子线性阴离子多糖，广泛存在于人体和动物的滑膜液、脐带、眼睛等组织，具有高吸水性、黏弹性、生物相容性、非免疫原性、降解产物无毒等独特特性，与细胞基质和细胞表面受体具有良好的相互作用[1-4]。由于透明质酸分子存在大量羧基和羟基等活性基团，易于化学改性，透明质酸基水凝胶被广泛应用于组织再生[5]、生物给药[6]、微器件[7]等领域。

温敏水凝胶指低临界相转变温度(LCST)发生体积相转变的智能水凝胶，在生物医学、农学等领域具有广阔的应用前景[8-10]。聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)同时含有亲水的酰胺基团和疏水的异丙基，是一种典型的温敏材料，其低临界相转变温度为25～32 ℃，接近于人体温度，在LCST附近，PNIPAM 水凝胶会发生快速溶胀和消溶胀[11-13]，当温度低于LCST时，酰胺基团占主导地位，表现出亲水性，当温度高于LCST时，异丙基占主导地位，则表现出疏水性[14-15]。

智能药物控释水凝胶具有控制药物释放时间、保持较为稳定的持续释放速度、减少给药次数、提高药物生物利用率和疗效、减轻患者痛苦等优点，被广泛应用于生物给药等领域[16-18]。为进一步提高透明质酸基智能响应性水凝胶的稳定性，拓展其潜在应用范围，本课题组以透明质酸、甲基丙烯酸酐为原料，合成了甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)，控制HAMA和N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)两种前驱体摩尔比，以过硫酸铵(APS)为引发剂，通过自由基聚合反应，制备了系列HAMA/NIPAM-x复合水凝胶，并对其凝胶时间、溶胶-凝胶转化、微观形貌、溶胀、降解、流变学性能以及体外药物释放行为等进行了研究，以期可应用于短期和中长期药物释放等领域。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

透明质酸钠(HA)，山东银河生物科技有限公司；N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM，98%)，过硫酸铵(APS，AR)，甲基丙烯酸酐(94%)，氯化钠(NaCl，AR)，磷酸氢二钠(Na2HPO4，AR)，磷酸二氢钾(KH2PO4，AR)，氯化钾(KCl，AR)，氢氧化钠(NaOH，AR)，考马斯亮蓝G250，牛血清白蛋白(BSA，分子生物学级)，磷酸(H3PO4，85%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

精密pH 计，上海日岛科学仪器有限公司(PHS-3C)；傅里叶变换红外光谱仪，美国热电仪器公司(Nicolet-7500)；冷冻干燥机，西盟国际集团(FD 5-5)；扫描电子显微镜，日本日立公司(TM-4000)；核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司(Bruker Avance 600)；UV-vis分光光度计，上海佑科仪器设备有限公司(UV752N)；DHR-1型流变仪，美国TA仪器。

1.2 HAMA/NIPAM-x水凝胶的制备及性能测试

1.2.1 HAMA的合成与表征

将2.02 g HA溶解于200 mL去离子水中，加入3 mL甲基丙烯酸酐，用浓度为1 mol·L-1的NaOH溶液调节pH值至8～10，在0 ℃下反应24 h。反应结束后，将反应液在去离子水中透析5 d，去除未反应的原料及低分子量聚合物，冷冻干燥后得到白色絮状产物。HAMA的合成如图1所示。利用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)和核磁共振光谱仪(1H NMR)进行结构表征。改性接枝率约为61%。

图1 HAMA的合成Fig.1 Synthesis of HAMA

FT-IR(cm-1，KBr)：3 429 (w)，1 721(w)，1 655(w)，1 553(w)，1 460(s)，1 388(s)，1 297(s)，1 154(w)，1 079(w)，1 045(s)，946(w)，887(m)，618(m)。

1.2.2 HAMA/NIPAM-x水凝胶的制备

以去离子水为溶剂，配制浓度为8%(m/V)的HAMA和5%(m/V)的NIPAM水凝胶前驱体溶液，控制nHAMA∶nNIPAM分别为1∶1.72,1∶1.38,1∶1.16,1∶1 和 1∶0.87，以1%(m/V)的APS溶液为引发剂，在70 ℃下反应，制备了HAMA/NIPAM-x(x=1，2，3，4，5)系列水凝胶，凝胶时间为40 min左右。HAMA/NIPAM-x水凝胶的制备如图2所示，具体情况如表1所示。

图2 HAMA/NIPAM-x系列水凝胶制备示意图Fig.2 Schematic diagram of preparation of HAMA/NIPAM-x hydrogels

表1 HAMA/NIPAM-x系列水凝胶的制备Table 1 Preparation of series of HAMA/NIPAM-x hydrogels

1.2.3 水凝胶的性能测试

(1) 冻干水凝胶的微观形貌：将脆断水凝胶样品置于导电胶上，用小型离子溅射仪对样品断面进行喷金处理，用TM-4000扫描电镜在15 kV进行微观形貌观察。

(2) 溶胀和降解：将水凝胶浸泡在不同温度(25，30，32，37 ℃)的PBS溶液(pH值 7.4)中，用称重法对HAMA/NIPAM-x系列水凝胶的溶胀率和降解百分数进行测定。用设定时间点水凝胶样品的初始质量与溶胀后的质量计算不同时刻水凝胶的溶胀率SR=(Ws-W0)/W0。其中，W0为初始干凝胶的质量，Ws为设定时间溶胀后水凝胶的质量。用干水凝胶样品的初始质量和设定时间干水凝胶样品的质量，计算不同时刻水凝胶的降解百分数PD% = (W0-Wt)/W0×100。其中，W0为干水凝胶样品的初始质量，Wt为t时刻降解后干水凝胶的质量。

(3) 药物负载：以PBS溶液(pH 值7.4)为溶剂，牛血清白蛋白(BSA)为药物模型，将冻干HAMA/NIPAM-x系列水凝胶样品置于浓度为10 mg·mL-1的BSA溶液中，浸泡48 h使其充分载药，得到载药水凝胶，取100 μL浸泡液用考马斯亮蓝G250染色，用UV-vis分光光度计在595 nm处测量其吸光度，计算药物负载率AR%=(mi/m0)×100。其中，mi为水凝胶载药量，m0为药物量。

聚3，4-乙基二氧噻吩(poly3, 4-ethyl dioxythiophene，PEDOT)、聚3-辛基噻吩(poly(3-octylthiophene)，POT)、聚吡咯(polypyrrole，PPY)和聚苯胺(polyaniline，PAN)是本领域研究最广泛的导电聚合物。由于这些材料在形成聚合物之后都有大的π-π共轭体系是良好的电子导体，然后通过掺杂可体现出离子导电性，对于扩散到界面上的电子可通过发生氧化还原反应将离子所带电荷转化为电子传递到基体电极上；同时高分子聚合物又是疏水的，极大地避免了电极与敏感膜之间水层的形成[7]。

(4) 体外药物释放：将载药HAMA/NIPAM-x干水凝胶置于不同温度(25 ，30 ，32 ，37 ℃)的PBS 溶液(pH值7.4)中，测定不同时刻BSA的累积释放百分数PCR%= (mt/mi)×100。其中，mi为水凝胶的初始载药量，mt为不同时刻BSA的累积释放量，即mt=ct×5+∑ct-1×0.1，ct为不同时刻BSA在释放液中的浓度。

(5) 流变学性能：制备直径为2 cm、厚度为0.5 cm的HAMA/NIPAM-x系列水凝胶样品，在37 ℃、应力为10 Pa条件下，利用DHR-1型旋转流变仪测试水凝胶储能模量(G′ )与损耗模量(G″ )随角频率ω(1～100 rad·s-1)的变化。

2 结果与讨论

2.1 HAMA/NIPAM-x系列水凝胶体系溶胶-凝胶转化及冻干水凝胶脆断面微观形貌

HAMA/NIPAM-x系列水凝胶为以HAMA为主链、NIPAM为接枝侧链的具有温度响应性的水凝胶，通过控制HAMA和NIPAM的摩尔比，实现对HAMA/NIPAM-x系列水凝胶网络结构调节。

利用倒置法观察体系溶胶-凝胶转化过程，图3为HAMA/NIPAM-1(HAMA为最低浓度)体系溶胶-凝胶转化图。由于常温下不能引发该体系形成水凝胶，从图3(a)可以看出在常温下体系为溶液，当温度达到引发剂APS的引发温度时，便形成如图3(b)所示的水凝胶。

图3 体系溶胶-凝胶转化图Fig.3 Diagram of sol-gel transformation of the hydrogels sestem

将HAMA/NIPAM-x系列水凝胶冷冻干燥，液氮冷却脆断后，观察断面微观形貌。从图4可以看出，水凝胶均具有连续的三维多孔结构，HAMA/NIPAM-1，HAMA/NIPAM-2，HAMA/NIPAM-3，HAMA/NIPAM-4和HAMA/NIPAM-5的平均孔径分别为250，159，125，139，89 μm，呈逐渐减小的趋势。这是由于在相同NIPAM用量下，随着HAMA用量的增加，体系内部与NIPAM的交联点数量增加，分子链之间的缠绕更紧密，交联密度增大，孔密度增大，孔径变小。

图4 冻干水凝胶脆断面的SEM图Fig.4 SEM images of the cross-section of lyophilized hydrogels

2.2 HAMA/NIPAM-x水凝胶的溶胀

水凝胶的溶胀可大致分为3个阶段，即介质进入水凝胶网络、水凝胶内部分子链扩张松弛、达到溶胀平衡。

HAMA/NIPAM-x系列水凝胶在不同温度下PBS溶液(pH值 7.4)中的溶胀情况如图5所示。

图5 HAMA/NIPAM-x系列水凝胶在不同温度下的溶胀率Fig.5 Swelling ratio of series of HAMA/NIPAM-x hydrogels at different temperatures

2.3 HAMA/NIPAM-x水凝胶的降解

通过对水凝胶降解百分数的测定，可以在一定程度上分析水凝胶的稳定性，可结合其药物释放行为来综合研究其在人体生物医学方面的应用。水凝胶降解过程可分为三步：首先外部的PBS溶液进入水凝胶网络中；然后水凝胶内部分子链开始分散松弛，分子内部的键发生断裂；最后整个水凝胶在溶液中完全降解。

系列水凝胶在不同温度(25，30，32，37 ℃)的PBS溶液中浸泡30 d后，均能保持坚固的凝胶状态，表现出较好的稳定性。HAMA/NIPAM-1，HAMA/NIPAM-2，HAMA/NIPAM-3，HAMA/NIPAM-4和HAMA/NIPAM-5在不同温度下的最大降解百分数分别为19%，21%，26%，20%，26%，即系列水凝胶30 d降解百分数为19%～26%。从图6可以看出，随着温度升高，系列水凝胶的降解百分数呈现先降后升的趋势，在30～32 ℃ 降解情况出现一个转折，25 ℃下系列水凝胶的最大降解百分数为20% 左右，30 ℃和32 ℃时系列水凝胶的降解百分数有所下降，降解速度减慢，在37 ℃下降解百分数又有一定程度的升高。这可能是因为在低于其LCST时，水凝胶吸水性强，溶胀率高，其网络结构容易被破坏；在温度高于LCST时，其溶胀率较低，网络结构更松弛，同时温度越高，从动力学角度分析，也符合温度对反应速率影响的动力学特征，其降解速度也越快，因此表现出较高的降解百分数；温度在LCST范围内，水凝胶网络结构更加牢固，表现出温度响应性。另外，前驱体HAMA的浓度越高，未与NIPAM交联的HAMA越多，在PBS溶液中溶蚀失重越严重，导致降解百分数也愈大。

图6 PBS溶液中HAMA/NIPAM-x系列水凝胶在不同温度下的降解百分数(30 d)Fig.6 Degradation percentage of HAMA/NIPAM-x series hydrogels in PBS solution at different temperatures(30 d)

2.4 载药HAMA/NIPAM-x水凝胶的释放行为

以PBS为溶剂配制BSA标准溶液，在0～1 mg·mL-1浓度范围内，标准曲线的线性方程为y=0.748x+0.00603,R2=0.9961。

以牛血清白蛋白为药物模型，通过浸泡法和紫外分光度法对HAMA/NIPAM-x系列水凝胶的药物负载率进行研究，系列水凝胶的平均药物负载率为76%，表明其具有良好的药物负载能力。

利用冻干载药水凝胶浸泡在不同温度的PBS溶液(pH值7.4)中进行药物释放行为研究。从图7(e)可以看出，该系列水凝胶在30 ℃ 时药物释放率最高，BSA累积释放率在10 d后最高接近99%；HAMA/NIPAM-1，HAMA/NIPAM-2，HAMA/NIPAM-3，HAMA/NIPAM-4和HAMA/NIPAM-5水凝胶在不同温度下的最大累积释放率为93%～99%，分别为 96%，98%，93%，96%和 99%，不同前驱体浓度的水凝胶差别不显著。如图7(a)- 图7(d)所示，药物释放初期，水凝胶内的药物浓度与外界PBS缓冲溶液的浓度差较大，此时药物分子从水凝胶的内部向外界溶液进行扩散的速度较快，表现出一定程度的“突释”现象，随着时间延长，内外浓度差逐渐减小，释放趋于平稳，此时释放遵循扩散机制。另外，在32 ℃时，由于温度处于LCST范围时，水凝胶的温度响应性导致其网络结构更加牢固，因此水凝胶的溶胀率更小，降解速率更慢，表现出10 d的累积释放率更低。综合该系列水凝胶的溶胀行为和降解行为特点，可以认为载药水凝胶的药物释放以扩散机制为主导，可以潜在应用于短期乃至中长期药物控制释放。

图7 在不同温度PBS溶液(pH值7.4)中载药HAMA/NIPAM-x水凝胶的药物释放行为和10 d 累积释放百分数Fig.7 Drug release behavior of the series of BSA-loaded HAMA/NIPAM-x hydrogels in PBS solution (pH 7.4) at different temperatures and cumulative release percentage for 10 days

2.5 HAMA/NIPAM-x系列水凝胶的流变学性能

在振荡频率扫描模式下，对HAMA/NIPAM-1，HAMA/NIPAM-3和HAMA/NIPAM-5三个不同前驱体浓度的水凝胶进行流变学行为研究。图8描述了系列水凝胶的储能模量(G′)、损耗模量(G″)、复合黏度(|*η|)、复合模量(|*G|)随角频率(ω)的变化趋势。从图8(a)、图8 (b)可以看出，HAMA/NIPAM-x系列水凝胶在1～100 rad·s-1的角频率范围内，G′，G″ 以及 |*G| 没有明显的起伏变化，且在此范围内G′ 均大于G″，表明水凝胶形成了较为稳定的三维网络结构，具有一定的弹性行为和类似固体的流变特性。HAMA/NIPAM-1，HAMA/NIPAM-3和HAMA/NIPAM-5水凝胶的储能模量在角频率100 rad·s-1时分别为1 210，3 020，4 850 Pa，说明前驱体浓度越高，形成的水凝胶内部网络结构更加紧密，力学性能越好。从图8(c)可以看出，所有的水凝胶均具有剪切变稀的特性。

图8 HAMA/NIPAM-x系列水凝胶的流变特性Fig.8 Rheological properties of series of HAMA/NIPAM-x hydrogels

3 结论

以天然多糖透明质酸(HA)为基质，通过甲基丙烯酸酐(MA)化学改性得到甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)，再通过过硫酸铵(APS)引发HAMA和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)的自由基聚合反应，制备了系列HAMA/NIPAM-x复合水凝胶，并对系列水凝胶的结构、微观形貌及体外药物释放等性能进行了研究。结果表明，HAMA/NIPAM-x系列复合水凝胶具有连续的三维网络结构以及较好的溶胀性能、力学性能和药物负载能力，在模拟人体生理微环境(pH值7.4的PBS溶液中)下，稳定性高，能够实现载药的持续稳定释放，可用于长期药物释放的载体，在短期和中长期药物释放领域具有潜在的应用价值。