活血止痛汤对椎间盘退变大鼠髓核细胞IRE1α/JNK通路的影响*

王安森，李 祥，叶鑫璇，黄美玲，闵水平，谢卫勇

（深圳市龙岗区骨科医院 1.康复科，2.骨科，深圳 518116）

椎间盘退变是引起慢性腰痛和坐骨神经痛的主要原因，可严重影响患者身心健康。普通药物治疗和外科治疗不能从根本上缓解疾病，且有复发的风险，而中医药在该病的预防和治疗方面已有一千多年的历史[1]。其中，出自《伤科大成》的活血止痛汤，具有活血止痛的功效，主治损伤瘀血、红肿疼痛，对于治疗骨折术后肢体肿胀疼痛有明显的效果，可显著缩短症状缓解时间[2]。椎间盘包括髓内核和周围纤维环，髓核细胞是驻留在髓内核中的主要细胞类型，负责合成胶质细胞外基质，维持椎间盘组织稳态。在退化的椎间盘组织中可观察到炎性细胞因子水平升高，诱导髓核细胞过度凋亡[3]。因此，椎间盘退化与髓核细胞的炎症和凋亡有关，所以通过抑制炎症和细胞凋亡可以抑制椎间盘退变[4]。其中，IRE1α/JNK 通路是细胞凋亡相关通路，激活结直肠癌中IRE1α/JNK 通路，可在体外诱导细胞凋亡[5]。另外，痤疮丙酸杆菌可通过JNK 通路促进髓核细胞凋亡，诱导椎间盘退变[6]。但是活血止痛汤对椎间盘退变大鼠IRE1α/JNK 信号通路及髓核细胞凋亡的影响，目前尚未见有相关研究报道。本研究通过构建椎间盘退化大鼠模型并使用活血止痛汤干预该模型，探讨活血止痛汤对椎间盘退变大鼠IRE1α/JNK 信号通路及髓核细胞凋亡的影响，为椎间盘退变患者的治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性、8 周龄SPF 级SD 大鼠62只，体质量280～290g，购自南方医科大学，许可证号：SCXK（粤）2016-0041。符合国家实验室动物伦理保护标准及相关法律规定。按照3R 原则给予实验动物人道的关怀照顾。

1.1.2 实验药物 活血止痛汤成分为：当归12 g、炒赤芍12 g、陈皮9 g、地鳖虫12 g、乳香5 g、没药5 g、三七9 g、苏木12 g、川穹6 g、红花3 g、积雪草6 g、紫荆藤10 g，由深圳中医院制剂室统一制备，含量为0.67 g 生药/mL。尼美舒利分散片（规格：0.1 g×10片，批准文号：国药准字H20020196）购自南昌市飞弘药业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 椎间盘退变大鼠模型的建立及分组 参考仇湘中等[7]采用的方法建造椎间盘退变大鼠模型。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，以仰卧位固定四肢，腹部剃毛，碘伏消毒。取右侧旁正中切口，长约2 cm，逐层剖开，将肠管用湿纱布包裹，向头侧和对侧推移，使腹后壁暴露，剪开腹后膜，保护好下腔静脉。以左右骼嵴为定位标志，骼嵴平对L6椎体或L5～L6椎间盘，将腰大肌从脊柱附着点上阶段性剥离，使L4～L5 和L5～L6 椎间盘暴露。用22G针头在椎间盘中部进行穿刺，使针刺角度与椎间盘矢状面呈0～60°，并平行于软骨，穿刺深度约2 mm，停留时间约10 s。穿刺完成后，依次缝合腹膜、筋膜及皮肤（假手术组仅暴露椎间盘，不进行穿刺），并连续3 d 腹腔注射青霉素20 万U，以防感染。将大鼠置于25℃左右环境中，正常饲喂4周，然后造模组和假手术组各取2只大鼠进行椎间盘组织形态学观察，用于验证造模成功[8]。其中造模期间有2只大鼠死亡，均为造模组。共造模成功50只大鼠，使用随机数字表法分为模型组，活血止痛汤低、中、高（1.75 g 生药/kg、2.50 g 生药/kg、5.00 g 生药/kg，根据动物以人等效给药剂量换算）剂量组和阳性对照组（尼美舒利分散片，0.18 mg/kg[9]），每组10 只，另取10 只假手术组大鼠。连续正常饲喂20 d，每天灌胃给药1 次，给药体积10 mL/kg，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。

1.2.2 HE 染色观察各组大鼠椎间盘组织病理学变化

末次给药结束后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉实施安乐死，切开上述“1.2.1 项”中的原切口，截取L4～L5 腰椎及其间的椎间盘组织，无菌生理盐水洗去血渍并分组放置，随机选取各组部分椎间盘组织迅速置于4%多聚甲醛中固定（剩余部分放入冻存管内并置于液氮中，用于后续实验）。固定24 h后，使用石蜡包埋，并用切片机制成4 μm 厚切片，然后参照HE 染色试剂盒说明书依次进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木素染色6 min、分化液分化30 s、伊红染色2 min、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固后，室温凉干后，于光学显微镜下观察椎间盘组织病理变化。

1.2.3 Masuda 评分法对各组大鼠椎间盘组织进行病理学评分

采用王宇鹏等[10]的Masuda评分法对上述“1.2.2项”中各组大鼠椎间盘组织进行病理学评分。

1.2.4 TUNEL 法检测各组大鼠椎间盘组织中髓核细胞凋亡率

将上述“1.2.2 项”切片二甲苯、乙醇脱蜡、脱水后，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min后，加入蛋白酶K 工作液，37 ℃反应30 min 后，PBS 缓冲液洗涤3次，每次5 min。玻片风干后，加入TUNEL工作液50 μL，加盖玻片避光反应1 h，PBS 清洗3 次，每次5 min，然后滴加适量2 mg/L DAPI 染液，颜色10 min，自来水冲洗掉多余染液，滤纸吸干，再滴加适量荧光封片液后，置于荧光显微镜下观察（激发波长520～560 nm），每组样品随机选取5 个视野，观察髓核细胞凋亡情况，其中红色荧光细胞为凋亡细胞，细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 ELISA法检测各组大鼠椎间盘组织中TNF-α和IL-1β含量

取上述“1.2.2 项”中置于液氮中的各组大鼠等质量椎间盘组织，使用等量RIPA裂解液裂解，4 ℃，2 500 r/min，离心20 min，取上清，按照TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 Western blotting法检测各组大鼠椎间盘组织IRE1α和JNK蛋白表达水平

取上述“1.2.2 项”置于液氮中的各组大鼠剩余椎间盘组织，使用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、转PVDF 膜、脱脂奶粉封闭、1∶2 000浓度稀释后的p-IRE1α、IRE1α、p-JNK、JNK、GAPDH一抗（1∶1 000）4 ℃过夜孵育、含辣根过氧化物酶缀合的二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，用ECL显色试剂盒显色，以GAPDH为内参，全能型凝胶成像分析系统分析蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 活血止痛汤对椎间盘退变大鼠椎间盘组织病理学变化的影响

假手术组大鼠椎间盘组织结构正常，未出现明显病理变化；模型组大鼠椎间盘组织结构紊乱，髓核基质严重凝结，髓核细胞明显减少，且纤维环严重断裂；活血止痛汤低、中、高剂量组大鼠椎间盘组织上述病理变化逐渐缓解；活血止痛汤高剂量组与阳性对照组大鼠椎间盘组织上述病理变化差异不明显，见图1。

图1 各组大鼠椎间盘组织HE染色图（400×）

2.2 活血止痛汤对椎间盘退变大鼠椎间盘组织病理评分的影响

与假手术组相比，模型组大鼠椎间盘组织病理学评分显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，活血止痛汤低、中、高剂量组大鼠椎间盘组织病理学评分均显著降低（均P＜0.05）,见表2。

表2 各组大鼠椎间盘组织病理评分比较

表2 各组大鼠椎间盘组织病理评分比较

与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与活血止痛汤低剂量组相比，cP＜0.05；与活血止痛汤中剂量组比较，dP＜0.05。

2.3 活血止痛汤对椎间盘退变大鼠椎间盘组织中髓核细胞凋亡率的影响

与假手术组相比，模型组大鼠椎间盘组织中髓核细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，活血止痛汤低、中、高剂量组大鼠椎间盘组织中髓核细胞凋亡率均显著降低（均P＜0.05），见图2和表3。

表3 各组大鼠椎间盘组织中髓核细胞凋亡率比较

表3 各组大鼠椎间盘组织中髓核细胞凋亡率比较

与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与活血止痛汤低剂量组相比，cP＜0.05；与活血止痛汤中剂量组比较，dP＜0.05。

图2 各组大鼠椎间盘组织中髓核细胞TUNEL检测图（400×）

2.4 活血止痛汤对椎间盘退变大鼠椎间盘组织中TNF-α和IL-1β含量的影响

与假手术组相比，模型组大鼠椎间盘组织中TNF-α 和IL-1β 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，活血止痛汤低、中、高剂量组大鼠椎间盘组织中TNF-α 和IL-1β 含量均显著降低（均P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠椎间盘组织中TNF-α和IL-1β含量比较 ng/L,

表4 各组大鼠椎间盘组织中TNF-α和IL-1β含量比较 ng/L,

与假手术组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与活血止痛汤低剂量组相比，cP＜0.05；与活血止痛汤中剂量组比较，dP＜0.05。

2.5 活血止痛汤对椎间盘退变大鼠椎间盘组织中IRE1α和JNK蛋白表达水平的影响

与假手术组相比，模型组大鼠椎间盘组织中IRE1α和JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，活血止痛汤低、中、高剂量组大鼠椎间盘组织中IRE1α 和JNK 蛋白磷酸化水平降低，且呈剂量依赖性（均P＜0.05）,见图3。

图3 各组大鼠椎间盘组织IRE1α和JNK蛋白表达水平比较

3 讨论

在全球范围内，人们普遍认为导致腰痛的主要原因是椎间盘退行性变，而椎间盘由内髓核构成，被纤维环包围，髓核细胞是驻留在髓核内的主要细胞类型，异常刺激可显著提高髓核中TNF-α和IL-1β水平，诱导椎间盘退变[11]。本研究发现，椎间盘退变大鼠的椎间盘组织结构紊乱，髓核基质严重凝结，髓核细胞明显减少，且纤维环严重断裂，其病理学评分、髓核细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β含量均显著升高，提示椎间盘退变大鼠髓核细胞凋亡较多，且伴随炎症反应。

非手术治疗或保守治疗已被证明能有效缓解椎间盘退变，是大多数患者的第一选择，所以，中医治疗方法普遍得到关注[12]。其中，活血止痛汤主治跌打损伤，淤血肿痛，症见局部淤血、肿胀疼痛，痛如针刺，因定不移，痛处拒按等，Ju等[13]研究发现，活血止痛汤的主要药理作用为镇痛和抗炎，能够减轻损伤局部肌纤维的变性，改善骨内血流动力学和血液流变学状态，达到保护软骨、治疗骨损伤的目的。克雷氏骨折患者早期使用活血止痛汤加减治疗，可显著减轻疼痛，消除瘀肿，临床疗效明显[14]。另外，活血止痛汤联合中药熏洗可有效缩短骨折愈合时间，使术后膝关节功能恢复良好并减少并发症的产生[15]，双极射频技术结合活血止痛汤浴足治疗，可缓解跖筋膜炎引起的足跟部疼痛[16]。另外，临床研究发现火龙灸结合加减通督活血汤治疗腰椎间盘突出症效果良显著[17]，且活血止痛膏对治疗腰椎间盘突出症的临床疗效确切，能有效降低复发率和提高患者生活质量[18]，其中药组分主要包括当归、黄芪、赤芍等，与本研究中的活血止痛汤方剂成分相似，推测这几味中药对椎间盘退变的治疗起主要作用，本研究发现，活血止痛汤可显著缓解椎间盘退变大鼠椎间盘组织的病理特征，降低其病理学评分、髓核细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β 含量，且呈剂量依赖性，提示活血止痛汤可显著缓解炎症反应，减少髓核细胞凋亡。

IRE1α/JNK 信号通路涉及多种生化进程，包括细胞凋亡和炎症反应。其中，Cheng 等[19]在高级别浆液性卵巢癌体内外实验中发现，激活IRE1α/JNK通路可诱导细胞凋亡。另外，胞内甲基乙二醛也可通过JNK通路诱导胰腺细胞发生炎性损伤[20]。本研究发现，椎间盘退变大鼠模型的椎间盘组织中IRE1α 和JNK 蛋白磷酸化显著升高，提示在该模型中IRE1α/JNK 信号通路处于激活状态。而Pei 等[21]研究发现，重组人肿瘤坏死因子蛋白6 能够通过抑制髓核细胞中JNK信号通路，进一步抑制细胞外基质降解和细胞凋亡，Wu等[22]研究发现艾塞那肽可通过抑制IRE1a/JNK 通路，保护人脐静脉内皮细胞免受衣霉素诱导的细胞凋亡。本研究发现，活血止痛汤可显著降低椎间盘退变大鼠的椎间盘组织中IRE1α和JNK蛋白磷酸化水平，且呈剂量依赖性，提示活血止痛汤可能通过抑制IRE1α/JNK 信号通路，降低椎间盘组织炎症反应，减少髓核细胞凋亡。

综上所述，活血止痛汤可能通过抑制IRE1α/JNK信号通路，减轻椎间盘退变大鼠椎间盘组织炎症反应，减少髓核细胞凋亡，缓解椎间盘病理症状。本研究初次探讨了活血止痛汤对椎间盘退变的作用机制，但是其中的作用机制较为复杂，尚需深入研究。