针刺对超负荷运动致骨骼肌损伤大鼠氧化应激损伤、骨骼肌细胞凋亡及相关信号通路的影响*

王水元，杨立志，李 明，崔 浩，熊 毅，高 举

（1.洪湖市人民医院康复医学科，洪湖 433200；2.华中科技大学同济医学院附属梨园医院康复医学科，武汉 430000）

随着人们对体育竞技的重视，教练员和运动员常采用超负荷训练以提高运动和竞技能力。但超负荷运动后，骨骼肌纤维会出现运动性肌肉损伤，不仅会出现延迟性肌肉酸痛还会使运动能力下降，若不采取及时治疗，将会加剧肌肉损伤，并造成慢性疼痛[1-2]。目前对于超负荷运动导致的骨骼肌损伤，主要依靠生化药物来缓解治疗，然而这些药物在被人体吸收的同时会产生代谢废物，有些代谢废物会产生毒副作用[3]。因此，探索出促进骨骼肌损伤快速恢复的安全有效的方法是目前运动医学界的当务之急。针灸是一种传统的中医治疗方式，和药物治疗相比，具有其特有的优势，且在肌肉劳损等病症方面已取得不错效果[4-5]。相关研究报道，针刺可以促进超负荷训练后骨骼肌线粒体结构的恢复，从而改善超负荷训练对骨骼肌的损伤程度[6]。孔梅等[7]研究报道，针刺干预可以有效增加肌膜下线粒体融合程度，减少胞膜窖数量，从而抑制超负荷运动引起的骨骼肌肌束膜衔接盘结构域的变化。刘晓然等[8]研究报道，针刺可以缓解骨骼肌微管的损伤，从而促进超负荷运动后骨骼肌的修复。但对于针刺在超负荷运动致骨骼肌损伤中是如何发挥修复作用的，其具体机制尚无定论。本研究旨在通过对大鼠进行超负荷训练以构建超负荷运动致骨骼肌损伤大鼠模型，予以针刺干预，探讨针刺对超负荷运动致大鼠骨骼肌损伤及相关信号通路的影响，以期为针刺在超负荷运动所致骨骼肌损伤的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

清洁级健康雄性SD 大鼠（许可证号：SYXK 2019-0108）60 只，45～55 日龄，体重250～300 g，购自劲牌有限公司；本实验经过动物伦理委员会批准同意且本动物实验严格遵循动物实验减少（Reduction）、优化（Refinement）和替代（Replacement）-3R原则。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（货号：RJ15503）购自上海仁捷生物有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（货号：ml097316）、琥珀酸脱氢酶（succinic acid dehydrogenase，SDH）试剂盒（货号：SDH）和超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）试剂盒（货号：ml077379）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（货号：ml076592）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒（货号：ml076416）均购自酶联生物有限公司；RAPI蛋白裂解液（货号：89900）购自北京雷根生物技术有限公司；PI3K抗体（货号：sc-365290）、AKT 抗体（货号：sc-5298）、HRP 标记的山羊抗兔二抗均购自圣克鲁斯生物技术公司；山羊抗大鼠IgG 二抗购自Abbkine 公司；内参小鼠抗β-肌动蛋白抗体（β-actin，货号：SY0632-QIK）购自北京百奥莱博科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自上海抚生实业有限公司。CytoFLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司；MH-2 型微型振荡仪购自北京铭成基业科技有限公司；SAF-680T酶标仪购自上海巴玖公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型构建

将适应性喂养1 周后的60 只大鼠随机分为5 组：健康对照组、超负荷组、针刺组、超负荷+针刺组，每组15只。健康对照组和针刺组不进行运动干预，超负荷组和超负荷+针刺组参照文献[9]通过超负荷运动建立骨骼肌损伤模型，具体操作如下：在1 m3的池中注深度为70 cm 的水，并使水温在33 ℃左右，第1 周每次先让超负荷组、超负荷+针刺组的大鼠入水中适应水性1 h，然后让大鼠负重其体质量5%的重物在水中训练1 h；第2 周则每次直接让大鼠负重其体质量8%的重物训练2 h。每组随机选取1 只大鼠检测血清睾酮与皮质酮水平，与健康对照组比较，若血清睾酮与皮质酮的比值下降40%[10]及以上，则表示造模成功。针刺组和超负荷+针刺组大鼠根据《实用动物针灸手册》的标准，参照文献[11]每次在大鼠超负荷运动后针刺大鼠双侧足三里、阳陵泉、内关和肾俞穴，留针20 min。造模及针刺过程中，健康对照组无动物死亡，超负荷组死亡3 只，针刺组死亡1 只，超负荷+针刺组死亡2 只，剩余54只全部进行实验。

1.2.2 血清CK和LDH活性检测

针刺干预结束后，每组随机选取6 只大鼠，经10%水合氯醛麻醉后，将大鼠断颈处死，分别取血清和骨骼肌组织，骨骼肌组织放入超低温冰箱中备用。血清于4 ℃下静置0.5 h 后，进行离心操作（3 000 r/min，10 min），分离血清。然后，按照试剂盒操作指南，检测大鼠血清中CK和LDH含量水平。

1.2.3 骨骼肌中氧化应激相关物质水平检测

取冰箱备用的部分骨骼肌组织，经0.9%生理盐水漂洗后，擦干称重，置于小烧杯中。用移液管量取0.86%的预冷生理盐水3 mL 和剪碎的组织倒入匀浆管中，充分研磨使组织匀浆化；然后转移到离心管内进行离心操作（3 000 r/min，10 min），离心后取下层沉淀，通过超声破碎仪将骨骼肌的线粒体破碎，加入2 mL裂解液，根据试剂盒说明操作，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组大鼠骨骼肌组织匀浆中MAD、GSH-Px、SDH和SOD水平。

1.2.4 苏木精—伊红（HE）染色

针刺干预结束后，每组随机选取3 只大鼠，经10%水合氯醛麻醉后，将大鼠断颈处死，取部分骨骼肌组织，剩余骨骼肌组织放入超低温冰箱中备用。将骨骼肌组织在4 ℃预冷的生理盐水中清洗，在冰上将组织剪成小块，置入浓度为10%的甲醛溶液中固定，待一天一夜后，置入乙醇脱水3 h；然后进行石蜡包埋、切片操作，放入60 ℃恒温箱20 min，把烤干的玻片放置在染色架上，然后放进二甲苯与乙醇等比混合液中，浸泡12 min后再放入二甲苯浸泡20 min，乙醇中浸泡25 min，将二甲苯洗后，放蒸馏水中浸泡2 min，苏木精中染色2 min，在小流量水下冲洗4 min，再放入伊红溶液中浸泡20 s，置于60 ℃恒温15 min，在乙醇中脱水6 min，二甲苯中浸泡20 min，然后通过树胶封片，烘干后，在生物显微镜下观片。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

取HE 染色中部分剩余骨骼肌组织，将其剪碎约1 mm3大小，搓洗后收集细胞悬液，然后进行离心，除去上清，用70%乙醇固定，经PBS 洗涤后，加入100 μL二甲基亚砜、20 μLAnnexinV-FITC及20 μL PI，37 ℃避光反应20 min，在流式细胞仪中检测细胞的凋亡率。

1.2.6 蛋白质印迹法

取HE 染色中剩余骨骼肌组织，在液氮中进行研磨，研磨后加入到RAPI裂解液中进行匀浆，然后进行离心操作（4 ℃，12 000 r/min），离心12 min，离心后EP管中液体分三层取上清液，通过蛋白质定量法测定蛋白含量后，进行SDS-PAGE电泳，通过半干法将分离的蛋白转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉在摇床中进行封闭（37 ℃，1 h），加入一抗（1∶1 000）（PI3K，AKT，Bcl-2和Bax抗体），β-actin（1∶1 000），4 ℃过夜，IgG二抗（1∶2 000），37 ℃下孵育1 h，显色成像并通过Image-ProPlus软件分析条带灰度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺对大鼠血清指标的影响

与健康对照组比较，超负荷组大鼠血清CK 和LDH水平明显升高（P＜0.05）；与超负荷组比较，针刺组和超负荷+针刺组血清CK和LDH水平明显降低（P＜0.05）；与针刺组比较，超负荷+针刺组血清CK和LDH水平显著升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清CK和LDH水平比较，n=6

表1 各组大鼠血清CK和LDH水平比较，n=6

与健康对照组比较，*P＜0.05；与超负荷组比较，#P＜0.05；与针刺组比较，&P＜0.05。

2.2 针刺对大鼠骼肌氧化应激水平的影响

与健康对照组比较，超负荷组大鼠MDA 水平明显升高，SOD、GSH-Px 和SDH 和水平明显降低（P＜0.05）；与超负荷组比较，针刺组和超负荷+针刺组MDA 水平明显降低（P＜0.05），GSH-Px、SOD、SDH 水平显著升高（P＜0.05）；与针刺组比较，超负荷+针刺组MDA 水平显著升高，GSH-Px、SOD 和SDH水平显著降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠骨骼肌中SOD、GSH-Px和SDH水平比较，n=6

表2 各组大鼠骨骼肌中SOD、GSH-Px和SDH水平比较，n=6

与健康对照组比较，*P＜0.05；与超负荷组比较，#P＜0.05；与针刺组比较，&P＜0.05。

2.3 HE染色观察针刺对大鼠骨骼肌损伤病理形态学的影响

HE 染色结果显示，健康对照组和针刺组大鼠的骨骼肌未见异常，肌纤维完整，细胞核大小形态均正常；超负荷组大鼠骨骼肌肌纤维不完整，肌纤维间细胞增生，细胞核固缩、溶解，可见炎性细胞浸润，胶原纤维增生严重；超负荷运动+针刺组病理程度明显减轻，只有少量炎性细胞浸润，肌纤维间细胞增生也明显变少。

2.4 针刺对大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响

健康对照组大鼠骨骼肌细胞凋亡率为（7.12±1.02）%、超负荷组为（28.64±2.31）%、针刺组为（9.03±1.25）%、超负荷+针刺组为（15.02±1.53）%（F=110.42，P＜0.001），与健康对照组比较，超负荷组大鼠骨骼肌细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；针刺组与健康对照组的骨骼肌细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与超负荷组比较，超负荷+针刺组大鼠骨骼肌细胞凋亡水平明显降低（P＜0.05），见图2。

图1 HE染色观察大鼠骨骼肌病理学变化（×400）

图2 各组大鼠骨骼肌细胞凋亡染色图

2.5 针刺对大鼠骨骼肌PI3K/AKT 信号通路的影响

与健康对照组比较，超负荷组PI3K、AKT 蛋白水平明显下调（P＜0.05）；针刺组中PI3K、AKT蛋白水平与健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与超负荷组比较，超负荷+针刺组组大鼠骨骼肌PI3K、AKT 蛋白水平明显上调（P＜0.05），见图3、表3。

表3 各组信号通路相关蛋白表达水平比较，n=3

表3 各组信号通路相关蛋白表达水平比较，n=3

与健康对照组比较，*P＜0.05；与超负荷组比较，#P＜0.05；与针刺组比较，&P＜0.05。

图3 针刺对PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响

2.6 针刺对大鼠骨骼肌凋亡蛋白表达的影响

与健康对照组比较，超负荷组Bcl-2 蛋白水平明显下调，Bax蛋白水平明显上调（均P＜0.05）。与超负荷组比较，超负荷+针刺组大鼠骨骼肌Bcl-2蛋白水平无显著差异（P＞0.05），Bax蛋白水平明显下调（均P＜0.05），见图4、表4。

图4 针刺对凋亡相关蛋白的影响

表4 各组凋亡相关蛋白表达水平比较，n=3

表4 各组凋亡相关蛋白表达水平比较，n=3

与健康对照组比较，*P＜0.05；与超负荷组比较，#P＜0.05；与针刺组比较，&P＜0.05。

3 讨论

针刺疗法作为一种传统的中医疗法，已经存在了数千年，且在骨骼肌损伤的治疗中取得了显著的效果[12]。有证据显示，在机体特定穴位进行针刺，刺激信号将通过组织间机械力的传导传递给周边组织，引发级联效应，最后致使细胞发生一系列功能性反应[13]。本研究为探索针刺对超负荷运动致骨骼肌损伤的作用及相关机制，通过将大鼠进行超负荷训练制造骨骼肌损伤大鼠模型，然后针刺大鼠足三里、阳陵泉、内关和肾俞穴3 个穴位，检测大鼠血清CK和LDH水平，观察骨骼肌病理形态学改变，检测与氧化应激损伤相关物质的含量、骨骼肌细胞凋亡情况以及相关通路蛋白的表达水平。中医认为，针刺肾俞穴和足三里具有补肾益精、增加体能的功效[14]。现代医学研究表明，针刺肾俞穴可以有效抑制氧化应激反应从而实现机体的正常生理反应和免疫反应；针刺阳陵泉穴和内关穴可以有效刺激机体的免疫系统，提升对炎症的抵御力[15]。以上证据说明了刺激这3个穴位的合理性和科学性。

CK 和LDH 作为骨骼肌损伤的生物标志物，可以反映骨骼肌微细损伤的程度[16]。当超负荷运动致使骨骼肌细胞膜遭到破坏，此时CK 和LDH 就会从细胞内渗漏到血液中，导致血清中CK 和LDH 水平明显升高。本实验发现，大鼠超负荷运动后血清中CK 和LDH 水平明显升高，而经针刺干预后，CK 和LDH水平明显降低。此外，在HE染色实验中，发现针刺后大鼠骨骼肌损伤程度明显减轻。说明针刺可以有效减轻大鼠骨骼肌的损伤程度。

在进行超负荷运动后，氧化应激是导致骨骼肌细胞损伤的重要因素之一[17]。超负荷运动后，体内活性氧会增多，会使细胞膜得通透性变强，进而氧化应激相关酶就会从细胞里被释放到细胞外[18]。MDA可以反映脂质过氧化程度。SOD可以反映自由基清除能力，有效清除活性氧。SDH是线粒体内膜的结合酶，为有氧呼吸提供电子，SDH活性越强，组织的氧利用能力就越强。GSH-Px可以清除由活性氧和脂质过氧化物，保护细胞膜结构和功能的完整性。本实验结果显示，针刺后MDA 水平显著降低，而SOD、SDH和GSH-Px水平均显著升高。说明针刺可以有抑制氧化应激反应，其原因可能是针刺关键穴位后使得大鼠SOD活性增强，增强清除自由基的能力，减轻脂质过氧化，最终有效抑制氧化应激反应，与Seo 等[19]报道的针刺可以有效减轻大鼠氧化应激反应的结论相一致。

细胞凋亡在骨骼肌损伤中发挥重要作用[20]。本研究结果发现，超负荷组骨骼肌细胞凋亡率较健康对照组明显升高，而经针刺干预后，细胞凋亡率明显下降，说明针刺可以有效降低大鼠骨骼肌细胞的凋亡。Bcl-2家族也参与控制细胞凋亡的发生，该家族调控细胞凋亡的主要蛋白包括Bcl-2 和Bax。当观察到Bax 蛋白表达升高，而Bcl-2 蛋白表达降低时，则预示细胞也启动了凋亡程序。本研究结果显示，与超负荷组比较，超负荷+针刺组大鼠骨骼肌Bcl-2 蛋白水平无显著差异，Bax 蛋白水平明显下调。这可能是因为研究所纳入样本量太少差异比较不具备统计学意义，后续可加大样本量进行研究，但Bcl-2 蛋白表达显著降低仍可表明细胞已启动凋亡程序。这一结果与赵晓琴等[21]报道的针刺可以缓解大鼠离心运动后骨骼肌细胞凋亡的结论相类似。而PI3K/AKT信号通路在调控细胞的凋亡中起着关键作用。本实验结果显示，大鼠超负荷运动后PI3K 和AKT 蛋白水平显著下降，而经针刺干预后，PI3K和AKT蛋白水平明显回升，提示针刺大鼠足三里、肾俞穴等关键穴位后，PI3K/AKT信号通路被激活，从而抑制了骨骼肌细胞的凋亡。这一结果与既往研究报道的针刺大鼠足三里等穴位会激活AKT信号通路，抑制骨骼肌细胞凋亡[22]的结论相类似。

综上所述，针刺可以缓解大鼠骨骼肌的损伤程度，其机制可能是针刺关键穴位后，PI3K/AKT信号通路被激活，从而抑制了骨骼肌细胞的凋亡，同时减轻了大鼠体内的氧化应激反应。