基于网络药理学结合细胞和分子实验探究地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的潜在靶点和作用机制*

郭兴喆，白先愚，杨萌哲，成南南，徐 宁，周守常，覃柳洁，黄建春，焦爱军△

（广西医科大学 1.生命科学研究院；2.生物化学与分子生物学教研室；3.药学院，南宁 530021）

鼻咽癌是一种好发于鼻咽侧壁和顶部、在我国南方地区发病率较高的恶性肿瘤之一[1]，在全世界范围内，超过半数的鼻咽癌病例都是发生在中国[2]。我国南部地区平均发病率约为3/10 000[3-4]。在鼻咽癌的治疗中，远处转移和局部浸润是治疗难处之所在[5]，需要使用放疗化疗相联合的综合治疗策略[6]。现阶段，需研发新的化疗辅助药物，以降低治疗期间的不良反应[7]。

近几年来，国家政策大力扶持中医药事业，但目前多以复方研究为主，因成分复杂，机制较难探索，限制了其临床应用及推广[8]。因此，中药单体的研发无疑为抗肿瘤中药提供了新的出路。大量文献表明，中药单体在抗癌作用上有显著的表现，很大程度上填补了传统中医药复方的短板。郭良芬等[9]的研究显示，采用中药单体治疗鼻咽癌，能显著减轻放化疗的急性毒副反应等不良反应，提高患者生存质量。因此，探寻潜在的抗癌中药，对改善临床疗效和提高患者生存质量具有重大意义。

地榆皂苷Ⅱ是一种三萜皂苷类化合物，化学式为C35H56O8，分子量为604.82，外文名称为Ziyuglycoside Ⅱ，提纯于中药地榆。中药地榆记载于著作《神农本草经》，具有收缩脉管、抗真菌、活血化瘀等作用，在临床上用于烫伤，炎症等疾病的治疗[10]。有文献表明，在乳腺癌细胞MDA-MB-435及胃癌细胞BGC-823中，地榆皂苷Ⅱ可以通过激活线粒体凋亡通路，抑制癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，从而达到抗癌目的[11-12]。在MDA-MB-231 和MCF-7 乳腺癌细胞株中，地榆皂苷Ⅱ能通过上调活性氧（ROS），引起细胞周期阻滞，并通过激活JNK及其相关下游凋亡通路，诱导细胞凋亡[13]。以上研究表明，地榆皂苷Ⅱ是良好的抗癌中药单体，但目前在抗鼻咽癌的效果和作用机制上尚未见报道。因此，本研究运用网络药理学的分析方法来预测地榆皂苷Ⅱ对鼻咽癌的潜在靶点及相关通路信息，再通过细胞和分子实验验证，从而为临床研究和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学分析预测

1.1.1 鼻咽癌靶点筛选

通过Pubchem 数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索关键词“Ziyuglycoside Ⅱ”得到其3D机构，再导入Swisstarget 平台（http://www.swisstargetprediction.ch/），可得到相关预测靶点。再通过GeneCards 数据库（http://www.genecards.org/）搜索关键词“鼻咽癌”，得到其相关靶点。通过韦恩图绘制在线平台（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制鼻咽癌与Ziyuglycoside Ⅱ的靶点交集图。

1.1.2 PPI（protein-protein interaction）的网络可视化构建及分析

通过String数据库（https://string-db.org/）将韦恩图取交集得到的基因数据输入到String 数据库，通过相关绘图软件绘制PPI网络图。

1.1.3 GO功能富集分析和KEGG pathway通路

通过David 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对鼻咽癌与Ziyuglycoside Ⅱ靶点交集进行京都基因与基因组百科全书（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析，得到相关靶点功能和通路分析。

1.1.4 化合物—靶点—通路网络图

收集地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的交集靶点和KEGG通路富集分析结果，并导入Cytoscape 3.7.2 软件构建制作“化合物—疾病—靶点—通路”关系网络图。

1.2 实验验证

1.2.1 CCK-8 法验证地榆皂苷Ⅱ对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用

采用CCK-8 法测定地榆皂苷Ⅱ对5-8F 细胞增殖抑制作用，取状态较好处于对数生长期的5-8F细胞，用含0.25%EDTA的胰酶消化，重悬为单细胞悬液，按照5 000/孔的细胞密度接种于96孔培养板中，在5%CO2的恒温培养箱中贴壁12 h，小心地吸出培养液，分别加入含地榆皂苷Ⅱ的培养基100 μL，浓度设为4 umol/L，每组设3 个复孔。在5%CO2的恒温培养箱中分别培养24 h、48 h、72 h 后，吸出含地榆皂苷Ⅱ的培养基，用PBS清洗2遍，按照CCK-8使用说明书，每孔加入100 μL RPMI-1640 培养基和10 μL CCK-8，于5% CO2的恒温培养箱中孵育80 min。用酶标仪检测在450 nm波长下各孔的光密度（A），计算地榆皂苷Ⅱ对细胞的抑制率并绘制细胞抑制率曲线。实验重复3次。

细胞生存率＝（A 地榆皂苷Ⅱ－A 空白）/（A 对照－A 空白）

1.2.2 Western blotting检测蛋白表达

取处于对数生长期的5-8F细胞，将细胞密度调整为5×105/mL 接种于6 孔板，体积为每孔1.5 mL，置于培养箱内培养24 h，4 umol/L 浓度药物处理细胞结束后，收集各组细胞，用PBS 缓冲液清洗3 次，再加入细胞裂解液裂解细胞30 min，之后用超声粉碎细胞；再将细胞液放置于低温离心机离心15 min，转移上清液于新的EP 管中，并用BCA 蛋白试剂盒测定具体蛋白浓度。一定量的蛋白样品与上样缓冲液按比例混合后煮沸5 min，SDS-PAGE电泳150 V恒压70 min，WB湿转（0.45 μm的PVDF膜）270 mA恒流65 h，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST漂洗3次后分别加入相应一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3 次，室温二抗（1∶5 000）反应1 h。用凝胶成像分析系统分析电泳条带，内参作为对照，计算各处理组目的蛋白的相对表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两样本均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学机制预测

2.1.1 地榆皂苷Ⅱ潜在靶点预测

通过PubChem分子库获得地榆皂苷Ⅱ的3D结构，见图1。将3D 结构导入至Swisstarget 平台中筛得地榆皂苷Ⅱ靶点，按照Probability排序，选取前10个基因名称和靶点，见表1。

表1 地榆皂苷Ⅱ排名前10的潜在靶点

图1 地榆皂苷Ⅱ的3D结构

2.1.2 地榆皂苷Ⅱ与鼻咽癌相关的共同靶点

从GeneCards数据库中获得与鼻咽癌相关的基因靶点共有1 942个。100个药物靶点基因与1 942个鼻咽癌相关基因筛选出共同交集靶点基因38个，为地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的潜在靶点基因，见图2。

图2 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的潜在靶点

2.1.3 地榆皂苷Ⅱ与鼻咽癌相关靶点的PPI网络

PPI网络为复杂疾病构建多种蛋白质的多因素功能的可视化图，因此，构建了地榆皂苷Ⅱ与鼻咽癌相关靶点的PPI 网络图。将38 个交集靶点导入STRING 数据库，获得地榆皂苷Ⅱ-鼻咽癌靶点PPI网络图，见图3。

图3 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌PPI网络图

2.1.4 GO功能富集注释

将疾病和药物交集的38 个共同靶点通过DAVID数据库进行GO功能富集分析，根据P≤0.01，共筛选出233 个GO 条目。按照P值升序排列结果前10条显著富集的条目，见图4。结果表明，涉及内肽酶活性、相同蛋白质结合等分子功能；涉及多项生物调控机制，包括凋亡过程的负调控、蛋白质水解、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、内皮细胞增殖的正调控等生物过程；涉及核质、细胞质、线粒体等细胞组成。推测地榆皂苷Ⅱ治疗鼻咽癌可能与内肽酶活性、激酶活性、金属内肽酶活性、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、蛋白质磷酸化的正调控等生物过程。

图4 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌GO功能富集分析

2.1.5 KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，共富集得到77条通路。根据P值排序，筛选出与鼻咽癌相关度最高的前19 条通路，见表2。富集结果显示在癌症信号通路（Pathways in cancer）、PI3KAkt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）等通路上富集较多。

表2 地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌KEGG富集结果

2.1.6 构建地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌的“药物—靶点—疾病—通路”网络模型

通过构建“药物—靶点—疾病—通路”网络模型图，可直观展示地榆皂苷Ⅱ与鼻咽癌交集靶点及通路之间的相互作用关系及关联程度，见图5。图中左侧38 个黄色节点代表地榆皂苷Ⅱ抗鼻咽癌交集的靶点，根据节点的度值按顺时针从大到小的梯度进行排列，右侧19个绿色节点则对应了KEGG富集结果中的19条通路，节点间的连线显示了通路和靶点间的相互作用关系，涉及的关键基因包括：AKT1、AKT2、MAPK10、PRKCA、GRB2、JUN、STAT3、MAPK14等。

图5 “药物—靶点—疾病—通路”网络图

2.2 实验验证

2.2.1 CCK8细胞毒性实验

结果如图6所示，与对照组相比较，随着地榆皂苷Ⅱ浓度的升高及作用时间的延长，其对5-8F细胞增殖抑制率明显升高，作用时长为24 h、48 h、72 h的半抑制浓度（IC50）分别为34.47 μmol/L、33.68 μmol/L、19.89 μmol/L。

图6 地榆皂苷Ⅱ对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响

2.2.2 Western blotting 实验检测地榆皂苷Ⅱ对PI3K和AKT蛋白表达的影响

Western blotting 实验检测结果显示，与对照组相比较，100 μmol/L 地榆皂苷Ⅱ实验组的AKT 和PI3K蛋白表达量显著低于空白对照组（P＜0.01），见图7。

图7 地榆皂苷Ⅱ对5-8F细胞PI3K/AKT信号通路蛋白的影响

3 讨论

鼻咽癌是一种起病隐逸、前期症状不明显、较难诊断和确诊的疾病，虽然放疗能大大提高患者生存率，但其带来的副反应也深深地折磨着患者，临床数据显示，多数患者在化疗后出现口舌干燥、口腔溃疡、吞咽困难、脑脊髓损伤等诸多副反应[14]。因此，这些治疗方式具有一定的局限性。

基于中药单体在肿瘤治疗中突出的疗效，近些年来对于中药单体治疗肿瘤的研究显著增加[15]，寻找能有效治疗肿瘤的中药单体，成为目前的研究热点和未来的发展方向。王振龙等[16]相关研究表示，中药单体地榆皂苷Ⅱ可激活细胞凋亡途径来抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，吴泽承等[17]也通过相关实验验证了地榆皂苷Ⅱ可有效抑制人舌鳞癌细胞CAL27细胞株的增殖。

本研究分析了地榆皂苷Ⅱ“药物—靶点—疾病—通路”网络模型，结果显示，AKT1、AKT2、MAPK10、PRKCA、GRB2 等度值较高，是地榆皂苷Ⅱ治疗鼻咽癌的关键潜在靶点基因。再结合KEGG通路富集分析，结果显示，在相关信号通路中，PI3KAKT 信号通路是地榆皂苷Ⅱ作用于鼻咽癌度值最高的关键通路。在PI3K-AKT 途径当中，PIP3 的3位磷酸基团可同时招募AKT 和PDK1 蛋白到细胞膜上，使PDK1 蛋白将AKT 蛋白上308 号位的苏氨酸（T308）磷酸化，致使AKT 蛋白部分活化，从而被活化的AKT 进一步调控激活下游通路。郭金兰等[18]的研究表明，miR-17-5p 可通过下调PIK3R1 基因从而靶向激活PI3K/AKT信号通路抑制皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡，促进细胞增殖，说明PI3K/AKT信号通路对癌细胞的增殖和凋亡有重要影响；朱文洁等[19]的研究则表明MiR-1268b 可以靶向下调ERBB2-PI3K-Akt 通路从而抑制乳腺癌化疗的耐药性，从另一个角度证实了可通过下调PI3K/AKT 信号通路相关关键蛋白的表达，达到干预癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡；而朱振华等[20]则发现KIF20A与细胞周期、凋亡等功能密切相关，通过在脑胶质瘤中下调KIF20A高表达后，PI3K/AKT信号通路被明显抑制，从而引起细胞周期阻滞和细胞凋亡。

本研究通过网络药理学预测结合细胞实验、分子实验等对地榆皂苷Ⅱ治疗鼻咽癌进行了多维度多层次的研究和比较分析，预测了地榆皂苷Ⅱ对鼻咽癌的作用通路并验证了其作用机制，本研究为未来鼻咽癌的临床治疗及实验研究提供了参考依据。