荜茇的化学成分及其与单胺氧化酶A的分子对接研究

刘新桥，宋炜，袁桥玉，唐丽杰

(1 中南民族大学 药学院， 武汉 430074；2 武汉职业技术学院 生物工程学院，武汉 430074)

荜茇为胡椒科植物荜茇(PiperLongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗；别名荜拨、荜拨梨.荜茇生于海拔约600米的疏林中，分布于云南东南至西南部，福建、广东、广西有栽培[1]. 荜茇具有温中散寒，下气止痛的功效[2]. 现代药理学研究表明，荜茇具有抗肿瘤、抗抑郁、降脂、抗菌抗炎、抗氧化等多方面的药理活性[3]. 为进一步研究荜茇的化学成分和抗抑郁活性，对氯仿萃取部位的化学成分进行分离与纯化，经结构鉴定，得到了11个化合物(图1)，并与抑郁症发生密切相关的靶点单胺氧化酶进行分子对接研究[4]，以期从中发现潜在的抗抑郁药物.

图1 化合物1～11的结构式Fig.1 Structures of compounds 1-11

1 实验部分

1.1 材料与仪器

荜茇采于云南，由中南民族大学药学院刘新桥副教授鉴定为荜茇(PiperLongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗. 200～300目硅胶，薄层色谱硅胶(青岛海洋化工)；葡聚糖凝胶LH-20 (美国GE)；50 μm反相硅胶(日本YMC)，甲醇(色谱级)(湖北弗顿生化)，乙腈(色谱级)(美国赛默飞)；二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、石油醚，正丁醇(均为分析纯)(国药集团).

600 MHz与500 MHz核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克)；制备液相色谱仪(Untimate3000,美国赛默飞)；半制备型色谱柱(C18柱，250 mm×20 mm，日本YMC)；旋转蒸发仪(RE2000A型，上海亚荣). Sybyl 1.0软件(美国Tripos)；PDB数据库(http://www.rcsb.org/)；Discovery Studio 2017 R2 Client(DS,BIOVIA公司).

1.2 提取和分离

取干燥荜茇果实5 kg，粉碎后过20目筛网，用95%、60%乙醇渗漉提取，减压浓缩得到总浸膏660 g，加水混悬后进行萃取，萃取的溶剂依次为石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇，得到石油醚部位176 g，氯仿部位220 g，乙酸乙酯部位10 g．正丁醇部位31 g. 取氯仿层187 g，通过硅胶柱色谱(200～300目)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇进行梯度洗脱(100∶1∶0，20∶1∶0，10∶1∶0，8∶1∶0，6∶1∶0，4∶1∶0，3∶1∶0，2∶1∶0，1∶1∶0，1∶2∶0，1∶3∶0，0∶1∶0，0∶9∶1，0∶8∶2)，得到10个组分Fr.1～10. Fr.5经硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶乙酸乙酯(50∶1,30∶1,20∶1,10∶1,8∶1,6∶1,4∶1,2∶1)梯度洗脱，得到5个组分Fr.5.1～5.5. Fr.5.3经葡聚糖凝胶LH-20分离，用CHCl3∶CH3OH(1∶1)洗脱，得到3个组分Fr.5.3.1～Fr.5.3.3. Fr.5.3.2用ODS-HPLC纯化(65%甲醇)得到化合物1(7 mg,tR=22.0 min)、化合物2(265 mg,tR=29.1 min). Fr.5.4经葡聚糖凝胶LH-20分离，用CHCl3∶CH3OH(1∶1)洗脱，到4个组分Fr.5.4.1～Fr.5.4.4；Fr.5.4.2用ODS-HPLC纯化(71%甲醇)得到化合物7(20 mg,tR=24.3 min)和化合物8(18 mg,tR=19.8 min). Fr.3经硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶乙酸乙酯(500∶1，100∶1，50∶1，30∶1，20∶1，10∶1，8∶1，6∶1，4∶1)梯度洗脱，得到5个组分Fr.3.1～3.6. Fr.3.4经葡聚糖凝胶LH-20分离，用CHCl3∶CH3OH(1∶1)洗脱，得到4个组分Fr.3.4.1～Fr.3.4.4. Fr.3.4.2经反相硅胶柱分离，分别用50%、70%、90%甲醇水冲柱得到3部分Fr.3.4.2.1～Fr.3.4.2.3. Fr.3.4.2.3用ODS-HPLC纯化(86%甲醇)得到化合物4(12 mg,tR=12.6 min)；(70%乙腈)化合物5(4.4 mg,tR=18.9 min). Fr.3.4.3用ODS-HPLC纯化(79%甲醇)得到化合物10(10 mg,tR=17.5 min). Fr.6经硅胶柱层析分离，用二氯甲烷∶甲醇(500∶1，200∶1，99∶1，98∶2，97∶3，95∶5，93∶7，9∶1)梯度洗脱,得到7个部分Fr.6.1～6.7. Fr.6.2经葡聚糖凝胶LH-20分离，用CHCl3∶CH3OH(1∶1)洗脱，得到4个组分Fr.6.2.1～Fr.6.2.4. Fr.6.2.3经反相硅胶柱分离，分别用50%、70%、90%甲醇水冲柱得到3部分Fr.6.2.3.1～Fr.6.2.3.3. Fr.6.2.3.3用ODS-HPLC纯化(79%甲醇)得到化合物3(2.5 mg,tR=32.5 min). Fr.6.3经葡聚糖凝胶LH-20分离，用CHCl3∶CH3OH(1∶1)洗脱，得到4个组分Fr.6.3.1～Fr.6.3.4. Fr.6.3.3用ODS-HPLC纯化(80%甲醇)得到化合物6(9.8 mg,tR=23.7 min). Fr.6.4经葡聚糖凝胶LH-20分离，用CHCl3∶CH3OH(1∶1)洗脱，得到4个组分Fr.6.4.1～Fr.6.4.3，Fr.6.4.2用ODS-HPLC纯化(49%乙腈)得到化合物9(17 mg,tR=15.7 min). Fr.6.6经葡聚糖凝胶LH-20分离，用CHCl3∶CH3OH(1∶1)洗脱，得到3个组分Fr.6.6.1～Fr.6.6.4，Fr.6.6.4用ODS-HPLC纯化(60%甲醇)得到化合物11(27 mg,tR=15.2 min)

1.3 分子对接

先画出11个化合物的2D结构，后用ChemDraw 3D转化为3D结构，建立小分子配体数据库，将小分子导入SYBYL1.0采用Minimize进行结构优化，使用tripos力场进行能量最小化，给予Gasteiger-Huckel电荷，优化次数为10000次，将优化后得到稳定构象保存为mol2格式. 根据文献[5]报道把与抑郁症密切相关的靶点单胺氧化酶A作为对接靶点，从PDB数据库里下载单胺氧化酶A晶体结构2Z5X. 将下载的蛋白晶体导入到SYBYL1.0中进行去水，加氢、加电荷(Gasteiger-Huckel电荷)等优化后，提取蛋白中的原配体作为对接的活性位点，保存. 将小分子配体数据库与处理好的2Z5X在SYBYL1.0中Surflex-dock模块进行分子对接. 以对接总得分(Total Score)来评判小分子化合物与靶蛋白的结合能力；一般认为，Total Score≥7认为小分子配体与靶点蛋白结合活性较好[6-7].

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1：白色不定型粉末，分子式为C16H19NO3.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δH7.27 (1H,m,H-3),7.07 (1H,d,J=1.7 Hz,H-2′),6.95 (1H,dd,J=8.0,1.7 Hz,H-6′),6.80 (3H,m,H-4,H-5,H-5′),6.09 (1H,d,J=15.2 Hz,H-2),5.96 (2H,s,3″,4″-OCH2O-),3.08 (2H,m,H-1″),1.80 (1H,m,H-2″),0.93 (6H,m,H-3″,H-4″);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC169.2 (C-1),142.9 (C-4′,C-3′),142.3 (C-3),140.3 (C-5),132.5 (C-1′),126.1 (C-4),124.3 (C-6′),123.9 (C-2),109.5 (C-5′),106.8 (C-2′),102.9 (3″,4″-OCH2O-),48.2 (C-1″),29.6 (C-2″),20.7 (C-3″,C-4″). 以上波谱数据与文献[8]基本一致，所以鉴定化合物1为荜茇宁.

化合物2：浅黄色粉末，分子式为C16H19NO3.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δH7.49 (1H,ddd,J= 14.7,8.9,1.4 Hz,H-3),6.97 (1H,d,J= 1.7 Hz,H-2″),6.87 (1H,dd,J=8.0 Hz,1.7 Hz,H-6″),6.76 (1H, d,J=8.0 Hz, H-5″), 6.73 (2H, m, H-4,H-5), 6.43 (1H, d,J= 14.7 Hz, H-2), 5.96 (2H, s, 3″,4″-OCH2O-), 3.52 (4H, br s, H-2′,H-6′), 1.65 (2H, m, H-4′), 1.58(4H, m, H-3′,H-5′);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC169.5 (C-1),148.3 (C-3″),148.2 (C-4″),142.6 (C-3),138.3 (C-5),131.1 (C-1″),125.4 (C-4),122.6 (C-6″),120.1 (C-2),108.6 (C-5″),105.7 (C-2″),101.4 (3″,4″-OCH2O-),46.9 (C-2′),43.3 (C-6′),26.8 (C-3′),25.8 (C-5′),24.8 (C-4′). 以上波谱数据与文献[9]基本一致，所以鉴定化合物2为胡椒碱.

化合物3：白色固体，分子式为C20H23NO3.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δH7.27 (1H,dd,J=14.9,10.9 Hz,H-3),6.88 (1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),6.75 (1H,dd,J=8.0,1.6 Hz,H-6′),6.73 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.30 (1H,d,J=15.7 Hz,H-9),6.22 (1H,dd,J=15.1,10.9 Hz,H-4),6.11 (1H,dt,J=15.1,5.9 Hz,H-5),6.09 (1H,d,J=14.9 Hz,H-2),6.02 (1H,dt,J=15.7,6.7 Hz,H-8),5.93 (2H,s,3″,4″-OCH2O-),3.53 (2H,t,J=6.9 Hz,H-4″),3.50 (2H,t,J=6.9 Hz,H-1″),2.31 (4H,m,H-6,H-7),1.96 (2H,m,H-3″),1.86(2H,m,H-2″);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC165.3(C-1),148.0 (C-3′),146.8 (C-4′),142.1 (C-3),141.9 (C-9),132.2 (C-1′),130.3 (C-5),129.4 (C-8),127.9 (C-4),120.5 (C-2),120.4 (C-6′),108.4 (C-5′),105.5 (C-2′),101.1 (3″,4″-OCH2O-),46.4 (C-1″),46.0 (C-4″),33.3 (C-7),33.0 (C-6),26.5 (C-2″),24.5 (C-3″). 以上波谱数据与文献[10]基本一致，所以鉴定化合物3为1-[1-Oxo-9(3,4-methylenedioxyphenyl)-2E,4E,8E-nonatrienyl]-pyrrolidine.

化合物4：白色针晶，分子式为C21H27NO3.1H NMR (500 MHz,CDCl3):δH6.84 (1H,d,J=1.5 Hz,H-2′),6.79 (1H,dt,J=15.1,6.9 Hz,H-3),6.71 (1H,dd,J=8.0,1.6 Hz,H-6′),6.68 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.24 (1H,m,H-9),6.02 (1H,dt,J=15.9,7.0 Hz,H-8),6.00 (1H,d,J=15.1 Hz,H-2),5.88(2H,s,3″,4″-OCH2O-),3.55 (2H,br s,H-1″),3.43 (2H,br s,H-5″),2.17 (4H,m,H-4,H-7),1.60(2H,m,H-2″),1.52 (4H,m,H-3″,H-4″),1.46 (4H,m,H-5,H-6);13C NMR (126 MHz,CDCl3):δC165.5 (C-1),147.9 (C-4″),146.5 (C-3″),145.6 (C-3),132.2 (C-1′),129.5 (C-9),128.8 (C-8),120.5 (C-2),120.2 (C-6′),108.1 (C-5′),105.3 (C-2′),100.9 (3″,4″-OCH2O-),46.8 (C-5″),43.0 (C-1″),32.6 (C-7),32.3 (C-4),28.9 (C-6),27.9 (C-5),26.6 (C-2″),25.5 (C-4″),24.6 (C-3″). 以上波谱数据与文献[11]基本一致，所以鉴定化合物4为荜茇环碱.

化合物5：无色油状，分子式为C21H29NO3.1H NMR (500 MHz,CDCl3):δH6.88 (1H,d,J=1.5 Hz,H-2″),6.75 (1H,dd,J=8.0,1.5 Hz,H-6″),6.72 (1H,d,J=8.0,H-5″),6.27 (1H,d,J=15.8 Hz,H-9),6.03 (1H,dt,J=15.8,6.9 Hz,H-8),5.93 (2H,s,3″,4″-OCH2O-),3.54 (2H,t,J=5.6 Hz,H-6′),3.38 (2H,t,J=5.6 Hz,H-2′),2.16 (2H,m,H-7),1.63 (2H,m,H-3),1.61 (2H,m,H-4′),1.53 (4H,m,H-3′,H-5′),1.45 (2H,m,H-6),1.36(4H,m,H-4,H-5);13C NMR (126 MHz,CDCl3):δC171.6 (C-1),148.0 (C-3″),146.6 (C-4″),132.6 (C-1″),129.5 (C-9),129.4 (C-8),120.3 (C-6″),108.3 (C-5″),105.5 (C-2″),101.0 (3″,4″-OCH2O-),46.9 (C-2′),42.7 (C-6′),33.6 (C-7),33.0 (C-2),29.5 (C-6),29.4 (C-5),29.1 (C-4),26.7 (C-3′),25.7 (C-5′),25.6 (C-3),24.7 (C-4′). 以上波谱数据与文献[10]基本一致，所以鉴定化合物5为piperolein B.

化合物6：黄色固体，分子式为C34H38N2O6.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δH6.88 (1H,d,J=1.5 Hz,H-7″),6.81 (1H,s,H-7),6.73 (1H,dd,J=8.0,1.5 Hz,H-11″),6.72 (1H,br s,H-11),6.70 (2H,m,H-10,H-10″),6.32 (1H,d,J=15.6 Hz,H-5),6.30 (1H,br s,H-5″),6.20 (1H,dd,J=15.4,10.1 Hz,H-4″),6.03 (1H,dd,J=15.6,8.6 Hz,H-4),5.94 (2H,m,H-12),5.91 (2H,m,H-12″),4.18 (1H,t,J=8.7 Hz,H-2),3.88 (1H,t,J=8.7 Hz,H-2″),3.72 (1H,m,H-5′α),3.64 (1H,m,H-5‴α),3.52 (1H,m,H-3″),3.49 (1H,m,H-5‴β),3.45 (2H,m,H-1‴),3.38 (1H,m,H-5′β),3.30 (2H,m,H-1‴α,H-3),3.24(1H,m,H-1′β),1.60 (2H,m,H-3‴),1.53 (4H,m,H-3′,H-4‴),1.44 (2H,m,H-4′),1.53 (4H,m,H-2′,H-2‴);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC171.0 (C-1),169.1 (C-1″),148.1 (C-9),148.0 (C-9″),147.2 (C-8,C-8″),133.3 (C-5″),131.7 (C-6),131.6 (C-6″,C-5),127.2 (C-4),125.0 (C-4″),121.0 (C-11),120.9 (C-11″),108.4 (C-10,C-10″),105.9 (C-7″),105.7 (C-7),101.2 (C-12),101.1 (C-12″),47.0 (C-5‴),46.0 (C-1′),44.8 (C-3″),43.5 (C-3),43.4 (C-5′),42.8 (C-1‴),41.5 (C-2″),41.0 (C-2),27.0 (C-2′),26.4(C-2‴),25.9 (C-4′),25.7 (C-4‴),24.7 (C-3‴),24.6(C-3′).以上波谱数据与文献[12]基本一致，所以鉴定化合物6为dipiperamide G.

化合物7：白色粉末，分子式为C20H18O6.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δH6.85 (2H,d,J=1.4 Hz,H-2,H-2″),6.80 (2H,dd,J=7.9,1.4 Hz,H-6,H-6′),6.78 (2H,d,J=7.9 Hz,H-5,H-5′),5.95 ( 4H,s,3,4-OCH2O; 3′,4′-OCH2O),4.71 (2H,d,J=4.4 Hz,H-7,H-7′),4.23 (2H,m,H-9α,H-9′α),3.87 (2H,dd,J=9.2,3.3 Hz,H-9β,H-9′β),3.05 (2H,m,H-8,H-8′);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC148.1 (C-3,C-3′),147.2 (C-4,C-4′),135.1 (C-1,C-1′),119.5 (C-6,C6′),108.3 (C-5,C-5′),106.6(C-2,C-2′),101.2 (C-3,C-4-OCH2O; C-3′,C-4′-OCH2O),85.9 (C-7,C-7′),71.8 (C-9,C-9′),54.4 (C-8,C-8′).以上波谱数据与文献[13]基本一致，所以鉴定化合物7为芝麻素.

化合物8：白色粉末，分子式为C21H22O6.1H NMR(600 MHz,CDCl3):δH6.93(1H,s,H-2),6.87 (1H,d,J=1.8 Hz,H-2′),6.85 (2H,d,J=8.3 Hz,H-5,H-6),6.82 (1H,dd,J=8.1,1.8 Hz,H-6′),6.77 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),5.94 (2H,q,3″,4″-OCH2O-),4.86 (1H,d,J=5.5 Hz,H-7),4.41 (1H,d,J=7.1 Hz,H-7′),4.11 (1H,d,J=9.7 Hz,H-9′α),3.91 (3H,s,3-OCH3),3.88 (3H,s,4-OCH3),3.83 (2H,m,H-9′β,H-9α),3.32 (2H,m,H-9β,H-8),2.87 (1H,m,H-8′);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC148.9(C-3),148.1 (C-4),148.0 (C-3′),147.3 (C-4′),135.5 (C-1′),131.0 (C-1),119.7 (C-6′),117.8 (C-6),111.1 (C-5),109.0 (C-2),108.9 (C-5′),106.6 (C-2′),101.2 (3″,4″-OCH2O-),87.8 (C-7′),82.1 (C-7),71.1 (C-9′),69.9 (C-9),56.0 (3-OCH3,4-OCH3),54.7 (C-8′),50.2 (C-8). 以上波谱数据与文献[14]基本一致，所以鉴定化合物8为辛夷脂素.

化合物9：白色粉末，分子式为C21H24O6.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δH6.93(1H,s,H-2),6.90 (1H,d,J=1.7 Hz,H-2′),6.83-6.89(4H,m,H-5,H-6,H-5′,H-6′),5.67 (1H,s,4-OH),4.87 (1H,d,J=6.0 Hz,H-7′),4.43(1H,d,J=7.2 Hz,H-7),4.13 (1H,d,J=9.5 Hz,H-9α),3.91 (3H,s,3-OCH3),3.89 (3H,s,3′-OCH3),3.88 (3H,s,4′-OCH3),3.84 (2H ,m,H-9β,H-9′β,),3.33 (2H,m,H-9′α,H-8′),2.90(1H,m,H-8);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC148.9(C-3′),148.0 (C-4′),146.8 (C-3),145.4 (C-4),133.1 (C-1),131.0 (C-1′),119.3 (C-6),117.8 (C-6′),114.3 (C-5),111.1 (C-5′),109.0 (C-2),108.6 (C-2′),87.8 (C-7),82.1 (C-7′),71.1 (C-9),69.8 (C-9′),56.0 (3-OCH3,3′-OCH3,4′-OCH3),54.6(C-8),50.2 (C-8′). 以上波谱数据与文献[15]基本一致，所以鉴定化合物9为连翘脂素.

化合物10：无色油状液体，分子式为C15H26O.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δH2.54(1H,m,H-4),2.40-2.47 (1H,m,H-2a),2.25-2.32 (1H,m,H-10),2.14 (1H,d,J=15.9 Hz,H-6a),2.08-2.12 (1H,m,H-2b),1.89-2.00 (2H,m,H-3a,H-6b),1.78-1,84 (1H,m,H-8a),1.68-1.75 (1H,m,H-9a),1.52-1.59 (2H,m,H-9b,H-7),1.41-1.48 (1H,m,H-8b),1,26-1.31 (1H,m,H-3b),1.19 (3H,s,12-CH3),1.16 (3H,s,13-CH3),0.99(3H,d,J=7.3 Hz,14-CH3),0.95 (3H,d,J=7.3 Hz,15-CH3);13C NMR (150 MHz,CDCl3):δC140.2(C-5),139.0 (C-1),73.8 (C-11),49.8 (C-9),46.4 (C-2),35.5 (C-4),33.9 (C-7),33.8 (C-6),31.1 (C-3),28.0 (C-10),27.5 (C-14,C-15),26.1 (C-8),20.1 (C-13),19.9 (C-12). 以上波谱数据与文献[16]基本一致，所以鉴定化合物10为愈创醇.

化合物11：白色结晶，分子式为C7H6O2.1H NMR (600 MHz,DMSO-d6):δH7.92(2H,d,J=7.9 Hz,H-2,H-6),7.49 (1H,t,J=7.8 Hz,H-4),7.36 (2H,t,J=7.8 Hz,H-3,H-5);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6):δC170.0(-COOH),134.2 (C-4),132.2(C-1),130.6 (C-3,C-5),129.5 (C-2,C-6). 以上波谱数据与文献[17]基本一致，所以鉴定化合物11为苯甲酸.

2.2 对接结果及分析

11个化合物与引起抑郁症的关键靶点单胺氧化酶A(MAO)对接的得分见表1. 筛选出具有较好结合活性的化合物4个，分别为荜茇宁、1-[1-Oxo-9(3,4-methylenedioxy-phenyl)-2E,4E,8E-nonatrienyl]-pyrrolidine、荜茇环碱、piperolein B. 从表1可知，piperolein B与MAO对接得分为9.2943，结合最好. 因此，选择piperolein B(化合物5)与MAO对接复合物进行相互作用力分析(图2).

表1 荜茇化学成分与单胺氧化酶A对接结果Tab.1 Docking results of chemical constituents from Piper longum L.and monoamine oxidase A

图2 化合物5与2Z5X相互作用的2D图Fig.2 2D diagram of the interaction betweencompound 5 and 2Z5X

从图2中可以看出：化合物5与ALA111、VAL93、LEU97、VAL210、PHE352、TYR69、ILE335形成了疏水相互作用，与蛋白中大量氨基酸残基(SER209、PHE108、CYS323、ILE325、PHE208、ILE180、ILE207、ASN181、TYR407、MET350、LEU337、GLN215、GLY110)之间存在范德华力，并与THR211形成了Pi-Donor氢键；其中疏水相互作用力(烷基化和Pi-烷基化作用)起重要作用.

3 结语

通过对荜茇的氯仿部位的系统分离，得到6个化合物，其中化合物3、6、9、10、11为首次分离；其中化合物6为二聚酰胺类生物碱，为首次从该植物中分离出该类型生物碱. 通过与单胺氧化酶A对接，发现荜茇宁、1-[1-Oxo-9(3,4-methylenedioxyphenyl)-2E,4E,8E-nonatrienyl]-pyrrolidine、荜茇环碱、piperolein B可能具有较好的抗抑郁的活性. 本研究为从荜茇中进一步发现新型抗抑郁中药单体和先导化合物提供了参考.