黄连内生真菌Fusarium proliferatum化学成分的研究

2021-12-17雷新响位盼盼吕晓张娴叶可李正辉

中南民族大学学报（自然科学版） 2021年6期

雷新响，位盼盼，吕晓，张娴，叶可，李正辉

(中南民族大学药学院，武汉 430074)

黄连始载于《神农本草经》，为毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云南黄连的干燥根茎[1]. 黄连药材中含有生物碱、木脂素、香豆素、黄酮、萜类、甾体、有机酸、挥发油、多糖等多种化学成分，表现出抗菌、消炎、抗氧化、抗病毒等以及降糖作用的药理活性[2]. 但是药用植物种植周期较长、药用成分含量较低的特殊性以及大规模的开发利用，使黄连等一些药用植物成为稀缺资源[3-4]. 植物内生真菌具有培养周期较短、药用成分含量较高、易处理、获取成本较低等特点，是缓解一些药用植物匮乏的有效途径. 1993年，Stierle首次从短叶红豆杉的韧皮部中获得一株产抗癌物质紫杉醇的内生真菌，开启了药用植物内生真菌研究的新纪元. 为了进一步研究黄连内生真菌的化学成分，本文对黄连内生真菌Fusariumproliferatum的次生代谢产物进行了研究. 利用凝胶Sephadex-20、硅胶柱色谱层析及反向高效液相色谱等一系列分离方法，分离纯化得到9个化合物单体(图1).

图1 化合物1～9的结构式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-9

1 实验部分

1.1 仪器与材料

核磁共振波谱仪(600 MHz，德国Bruker)；核磁共振波谱仪(500 MHz，德国Bruker)；质谱仪(Autospec Premier P776,美国Waters).

FUJI C18填料，粒径为20～45 μm,孔径为100 A(赛谱锐思)；Sephadex-LH 20(瑞典Amersham biosciences)；柱色谱硅胶(200～300目)与薄层色谱硅胶板(青岛海洋化工厂)；分析型高效液相色谱为Agilent 1260，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm)，径粒为5 μm；制备型高效液相色谱为Agilent 1260，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(9.4 mm×250 mm)，径粒为5 μm；显色溶剂：香草醛溶液和硫酸乙醇溶液；观察荧光波长：254 nm和365 nm；色谱甲醇和乙腈(湖北弗顿).

1.2 培养方法

采用固体培养方法. 培养基：大米100 g，加水100 mL，置于500 mL三角烧瓶中，121 ℃灭菌15 min，共30瓶；培养条件：温度 24 ℃；静置，暗培养30 d.

1.3 提取分离

将固体发酵产物用2倍体积的浓度为80%甲醇提取3次，每次12 h,合并提取液，减压浓缩至5 L,加入等体积的乙酸乙酯萃取5次，萃取液合并后减压浓缩得到总浸膏56 g. 经正相硅胶柱层析用氯仿/甲醇(1∶0，20∶1，10∶1，4∶1，1∶1，0∶1)系统梯度洗脱得3个组分(A～C). 组分C经过甲醇-水(体积比为20∶80，40∶60，60∶40，80∶20)分离，得到16个亚组分C1～C16.

组分C3经正相硅胶柱层析(氯仿-甲醇)分离得到7个组分C3-1～C3-7，C3-4经过制备型HPLC(乙腈/水,5%～20%，18 min)分离得到化合物1(3.7 mg). C3-6经过制备型HPLC(乙腈/水,10%～20%,12 min)分离得到化合物2(2.9 mg).

组分C10经正相硅胶柱层析(石油醚/丙酮)分离得到9个组分C10-1～C10-9. C10-2经过制备型HPLC(乙腈/水,15%～20%，15 min)和制备型HPLC(乙腈/水，35%，20 min)分别分离得到化合物3(2.2 mg)和4(1.9 mg). C10-6经过制备型HPLC(乙腈/水，20%～35%，15 min)分离得到化合物5(1.3 mg).

组分C11经过Sephadex-LH 20(甲醇)分离得到10个组分C11-1～C11-10. C11-10经过制备型HPLC(乙腈/水,30%,15 min)分离得到化合物6(3.6 mg).

组分C12经过正相硅胶柱层析(石油醚/丙酮)得到7个组分C12-1～C12-7，C12-6经制备型HPLC(乙腈-水，55%，0～33 min；80%，34～40 min)分离得到化合物7(2.7 mg)、8(3.4 mg)、9(1.1 mg).

2 结构鉴定

化合物1:分子式C10H9NO3S，无色晶体.1H NMR(CD3OD,600 MHz): δH8.92(S,1H,H-2),7.29(d,J=2.3 Hz,1H,H-7),6.94(d,J=2.3 Hz,1H,H-5),4.10(s,2H,H-8),3.69(d,J=1.6 Hz,3H,H-10).13C NMR(CD3OD,150 MHz): δC173.65(C-9),157.16(C-6),152.73(C-2),147.31(C-3),136.62(C-1),130.97(C-4),118.19(C-5),106.55(C-7),52.57(C-10),38.16(C-8). 以上数据与文献[5]数据基本一致. 故化合物1被确定为methyl 2-(6-hydroxybenzothiazol-4-yl) acetate.

化合物2:分子式C14H16N2O2，白色粉末.1H NMR(CD3OD,600 MHz): δH7.30 - 7.21(m,5H，Ar-H),4.45(td,J=5.0,1.9 Hz,1H，H-9),4.07(ddd,J=10.9,6.3,2.0 Hz,1H,H-6),3.54(dt,J= 12.0,8.3 Hz,1H,H-3a),3.37(ddd,J=12.4,7.9,5.2 Hz,1H，H-3b),3.18(m,1H,H-10a),3.16(m,1H,H-10b),2.09(m,J=12.3,6.2,4.0 Hz,1H,H-5b),1.84 - 1.77(m,2H,H-4a,b),1.20(m,J=12.3,10.7,8.7Hz,1H,H-5a).13C NMR(CD3OD,150 MHz): δC170.91(C-1),166.91(C-7),137.32(C-1＇),131.07(C-2＇),129.46(C-6＇),128.09(C-3＇,5＇),60.07(C-6),57.69(C-9),45.95(C-3),38.22(C-10),29.39(C-5),22.75(C-4). 以上数据与文献[6]数据基本一致. 故化合物2被确定为cyclo-(L-Phe-L-Pro).

化合物3：分子式C10H9NO2，黄色粉末.1H NMR(CD3OD,600 MHz): δH8.06 - 8.04(m,1H,H-4),7.96(s,1H,H-2),7.44(dt,J=8.1,1.0 Hz,1H,H-7),7.22 - 7.16(m,2H,H-5,6),3.88(s,3H,H3-9).13C NMR(CD3OD,150 MHz): δC167.85(C-8),138.13(C-7a),133.20(C-2),127.28(C-3a),123.71(C-6),122.52(C-5),121.89(C-4),112.96(C-7),108.24(C-3),51.38(C-9). 以上数据与文献[7]数据基本一致. 故化合物3被确定为1H-indole-3-carboxylic acid methyl ester.

化合物4：分子式C11H12O4，淡黄色胶状.1H NMR(CD3OD,600 MHz): δH7.61(d,J=15.9 Hz,1H,H-1＇),7.19(d,J=2.0 Hz,1H,H-2),7.07(dd,J=8.1,2.0 Hz,1H,H-6),6.81(d,J=8.1 Hz,1H,H-5),6.37(d,J=15.9 Hz,1H,H-2＇),3.89(s,3H,H-7),3.77(s,3H,H-4＇).13C NMR(CD3OD,150 MHz): δC169.75(C=O),150.66(C-4),149.40(C-3),146.86(C-1＇),127.67(C-1),124.12(C-6),116.46(C-5),115.19(C-2＇),111.64(C-2),56.42(C-7),52.00(C-4＇). 以上数据与文献[8]数据基本一致. 故化合物4被确定为methyl ferulate.

化合物5：分子式C15H20N2O2，白色粉末.1H NMR(CDCL3,600 MHz): δH7.36 - 7.33(m,2H,H-3＇,5＇),7.31 - 7.27(m,1H,H-4＇),7.23-7.21(m,2H,H-2＇,6＇),6.02(s,1H,2-NH),5.88(s,1H,5-NH),4.24(ddt,J=9.5,3.7,1.8 Hz,1H,H-3),3.92(dq,J=3.0,1.5 Hz,1H,H-6),3.43(dd,J=13.8,3.6 Hz,1H,H-11a),2.92(dd,J= 13.8,9.7 Hz,1H,H-11b),2.05 - 1.98(m,1H,H-7),1.17(m,2H,H-8),0.98(d,J=7.1 Hz,3H,10-CH3),0.88(t,J=7.4 Hz,3H,9-CH3).13C NMR(CDCL3,150 MHz): δC167.17(C-1),166.76(C-4),135.49(C-1＇),129.74(C-3＇,C-5＇),129.31(C-2＇,C-6＇),127.73(C-4＇),60.24(C-6),56.17(C-3),40.48(C-11),38.19(C-7),23.65(C-8),15.43(C-10),11.89(C-9). 以上数据与文献[9]数据基本一致. 故化合物5被确定为 Cyclo-(D-Phe-L-Ile).

化合物6：分子式C40H36N6O4，黄色粉末.1H NMR(CD3OD,600 MHz): δH7.58(dd,J=8.0,0.9 Hz,1H,H-27),7.23(dt,J=4.1,1.4 Hz,3H,H-43,44,45),7.14(tt,J=7.4,1.3 Hz,1H,H-42),7.12-7.08(m,4H,H-46,21,19,23),7.02-7.00(m,2H,H-20,22),6.92-6.87(m,4H,H-26,31,7,25),6.77(d,J=7.9 Hz,1H,H-8),6.64-6.58(m,2H,H-1,6),5.80(s,1H,H-2),4.25(t,J=4.4 Hz,1H,H-15),3.47(td,J=4.6,1.1 Hz,1H,H-37),3.43(td,J=4.6,1.1 Hz,1H,H-34),3.23-3.15(m,3H,H-11,33a,12a),3.08-3.06(m,1H,H-17a),3.05(t,J=3.8 Hz,1H,H-40a),2.93(dd,J=13.7,4.7 Hz,1H,H-17b),2.82(dd,J=14.0,4.8 Hz,1H,H-33b),2.74(dd,J=11.8,5.9 Hz,1H,H-40b),2.05-2.00(m,1H,H-12b).13C NMR(CD3OD,150 MHz): δC169.96(C-39),169.16(C-13),168.19(C-16),167.63(C-36),147.18(C-9),135.09(C-18),135.08(C-41),134.93(C-29),133.72(C-4),132.03(C-4),129.90(C-42,C-46),129.56(C-23,C-19),129.02(C-28),128.62(C-7),128.29(C-20,C-22),128.04(C-43,C-45),127.47(C-21),126.83(C-44),124.67(C-31),122.88(C-5),122.8(C-24),119.26(C-27),118.98(C-26),118.78(C-25),118.37(C-6),110.23(C-8),108.52(C-32),83.07(C-2),58.54(C-15),57.07(C-3),56.72(C-11),55.21(C-37),54.96(C-34),39.35(C-17),38.23(C-12),38.21(C-40),28.52(C-33). 以上数据与文献[10]数据基本一致,故化合物6被确定为Asperazine.

化合物7：分子式C32H26O10，黄色无定形粉末.1H NMR(CDCL3,600 MHz): δH15.25(s,1H,5＇-OH),12.84(s,1H,5-OH),7.05(s,1H,H-6),6.97(s,1H,H-7),6.43(d,J=2.2 Hz,1H,H-7＇),6.34(d,J=0.8 Hz,1H,H-3),6.18(d,J=2.3 Hz,1H,H-9′),6.00(d,J=0.9 Hz,1H,H-3＇),4.03(s,3H,H-13＇),3.78(s,3H,H-12),3.61(s,3H,H-11＇),3.43(s,3H,H-11),2.49(d,J=0.7 Hz,3H,H-13),2.12(d,J=0.8 Hz,3H,H-12＇).13C NMR(CDCL3,150 MHz): δC184.47(C-4＇),182.86(C-4),167.40(C-2),166.78(C-2＇),162.69(5＇-OH),161.47(C-8＇),161.00(C-6＇),159.91(C-8),156.79(C-10),156.57(5-OH),154.99(C-10b),150.73(C-10＇a),140.68(C-6a),140.53(C-9＇a),117.04(C-7),110.56(C-3),109.28(C-4a),108.48(C-10a),107.88(C-3＇),107.27(C-6),105.93(C-10＇a),104.91(C-10＇),104.14(C-4＇a),101.47(C-7),96.87(C-7＇),96.14(C-9＇),61.13(C-11),56.13(C-13＇),55.89(C-12),55.08(C-11＇),20.61(C-12＇),20.48(C-13). 以上数据和文献[12]数据基本一致. 故化合物7被确定为fonsecinone A.

化合物8：分子式C32H26O10，黄色无定形粉末.1H NMR(CDCL3,600 MHz): δH15.25(s,1H,5＇-OH),14.83(s,1H,5-OH),7.15(s,1H,H-10),6.97(s,1H,H-9),6.41(d,J=2.3 Hz,1H,C-7＇),6.20(d,J=2.3 Hz,1H,C-9＇),6.06(d,J=0.9 Hz,1H,C-3),5.98(d,J=0.9 Hz,1H,C-3＇),4.02(s,3H,H-11＇),3.79(s,3H,H-13),3.62(s,3H,H-12＇),3.46(s,3H,H-12),2.44-2.40(m,3H,H-11),2.12(d,J=0.8 Hz,3H,H-13＇).13C NMR(CDCL3,150 MHz): δC184.63(C-4＇),184.47(C-4),167.68(C-2),167.61(C-2＇),162.71(5-OH),161.99(5＇-OH),161.41(C-8),161.05(C-8＇),160.18(C-6＇),158.57(C-6),153.37(C-10a),150.84(C-10＇a),140.70(C-9a),140.55(C-9＇a),117.62(C-7),111.43(C-5a),108.56(C-5＇a),107.45(C-3),107.27(C-3＇),105.16(C-10＇),104.73(C-4a),104.28(C-4＇a),101.36(C-9),101.23(C-10),96.86(C-7＇),96.47(C-9＇),62.05(C-12),56.22(C-11＇),55.93(C-13),55.15(C-12＇),20.80(C-11),20.72(C-13＇). 以上数据与文献[11]基本一致. 故化合物8被确定为aurasperone A.

化合物9：分子式C32H26O10，黄色无定形粉末.1H NMR(CDCL3,600 MHz): δH15.34(s,2H,5-OH,5＇-OH),6.42(d,J=2.3 Hz,2H,H-7,7＇),6.04(d,J=2.3 Hz,2H,H-9,9＇),6.00(d,J=0.9 Hz,2H,H-3，3＇),4.05(s,6H,H-11,11＇),3.47(s,6H,H-12,12＇),2.03(d,J=0.7 Hz,6H,H-13,13＇).13C NMR(CDCL3,150 MHz): δC184.95(C-4,4＇),168.09(C-2，2＇),163.42(C-10a,10＇a),162.22(C-8,8＇),161.50(C-6，6＇),151.69(C-5，5＇),141.05(C-9a,9＇a),109.09(C-10，10＇),107.69(C-3，3＇),105.86(C-5a，5＇a),104.69(C-4a，4＇a),97.57(C-7， 7＇),96.73(C-9，9＇),56.60(C-11,11＇),55.62(C-12,12＇),21.01(C-13,13＇). 以上数据与文献[12]数据基本一致，故被确定为nigerone.

3 结语

通过对黄连内生菌Fusariumproliferatum的系统分离，得到了9个化合物单体. 其中化合物2和5为环二肽类化合物，据报道该类化合物具有激素调节、控制能量代谢、抗菌和抗肿瘤等作用[13]. 化合物6是二酮哌嗪异二聚体，细胞毒性试验发现对人癌细胞系PC3、A2780、K562、MBA-MD-231和NCI-H168化合物6均有较弱活性[10]. 化合物7、8、9是苯并吡喃酮二聚体类化合物，这类化合物对大鼠和小鼠的中枢神经系统表现出急性毒性作用[14]，并且对Taq DNA聚合酶具有抑制作用[15]. 本文分离得到的9个化合物单体，是否具有上述生物学功能，值得进一步研究和探索.