粪肠球菌铁富集能力研究

何万领，杨龙帮，李晓丽，李 旺，丁 轲，郭 殊，张晓丽

(1 河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023； 2 河南省生物发酵微量元素及安全评价工程技术中心，河南 鹤壁 456250)

微量元素是动物生长、发育、繁殖等生理过程所必需的，在饲料中补充一定量的微量元素是满足其生理需要的主要途径，但应用无机微量元素存在生物学效率低下、毒副作用大及环境污染等问题[1-3]。研究表明，微量元素的吸收需要有机配体参与[4]，直接饲喂有机微量元素将大大提高金属元素的利用效率，降低其添加量[5]。目前，有机微量元素的开发主要分为化工合成和生物转化两种途径[6]。由于微生物种类繁多、繁殖能力强，且与动物等生物体一样能够利用无机态微量元素，并将其转化为有机态形式[7-8],因此，筛选对微量元素具有较强耐受、富集及合成能力的有益态微生物，用于生产有机微量元素，已成为国内外的研究热点之一。本研究以实验室保存的耐铁粪肠球菌X4菌株为材料，研究其对铁的富集性能，以期为生物有机铁制剂的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌 种

粪肠球菌X4菌株，由河南科技大学生物饲料与精准营养实验室从猪粪便中筛选获得，其原始菌株耐铁质量浓度为300 mg/L，经紫外线照射诱导后其耐铁质量浓度达1 200 mg/L。

1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化钠5 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，若为固体培养基则加入20 g琼脂。

基础发酵培养基：葡萄糖15 g，酵母膏10 g，硫酸铵1 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钾1 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

以上培养基使用前均需在高压蒸汽灭菌器内121 ℃灭菌30 min。

1.3 试验仪器

立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)，上海申安医疗器械厂；高速冷冻离心机(L-80XP)，Beckman Coulter Co.,Ltd；电热恒温培养箱(DNP-9082A)和恒温摇床(BS-4G)，常州润华电器有限公司；15 L发酵罐(GUJS-15C)，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司；电感耦合等离子体光谱仪(Avio200)，Perkinelmer Singapore Pte Ltd。

1.4 粪肠球菌X4的生长曲线

从平板上挑取X4菌株接种至装有100 mL LB液体培养基的三角瓶中，于35 ℃活化12 h后，吸取30 mL接种至装有300 mL LB液体培养基的三角瓶中，35 ℃、180 r/min摇床培养24 h，每隔2 h从三角瓶中取出5 mL菌液，以未接种的LB液体培养基为空白对照，用紫外分光光度计在波长600 nm处测定吸光度值(OD600 nm)。以培养时间为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

1.5 X4铁富集单因素试验设计

单因素试验采用基础发酵培养基在250 mL三角瓶中进行，装液量50 mL，以菌体产量和铁富集率为指标，对铁离子质量浓度、加铁时间、X4菌液接种量、培养时间、碳源种类、有机氮源种类、无机氮源种类共7个因素依次进行优化。以上次筛选的最佳发酵参数作为下次参数筛选的条件。

1.5.1 铁离子质量浓度 共设置10个铁离子质量浓度，分别为0，100，200，300，400，500，600，800，1 000和1 200 mg/L，开始培养即加入相应铁离子溶液，每处理3个重复，菌液接种量为10%(体积分数,下同)，35 ℃、180 r/min振荡培养48 h。

1.5.2 加铁时间 共设置4个加铁时间，分别为开始培养0，6，12，18 h，每处理3个重复，铁离子质量浓度600 mg/L，菌液接种量10%，35 ℃、180 r/min振荡培养48 h。

1.5.3 菌液接种量 按体积分数设置4个菌液接种量，分别为5%，10%，15%和20%，每处理3个重复，铁离子质量浓度600 mg/L，加铁时间为培养12 h，35 ℃、180 r/min振荡培养48 h。

1.5.4 培养时间 在上述试验的基础上，共设置4个培养时间，分别为24，48，72和96 h，每处理3个重复，于35 ℃、180 r/min下振荡培养。

1.5.5 碳 源 在上述试验基础上，按照碳等量原则，分别用蔗糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉替换基础培养基中的葡萄糖，每处理3个重复，于35 ℃、180 r/min下振荡培养72 h。

1.5.6 有机氮源 在上述试验基础上，按照氮等量原则，分别用胰蛋白胨、蛋白胨和牛肉膏替换基础培养基中的酵母膏，每处理3个重复，于35 ℃、180 r/min下振荡培养72 h。

1.5.7 无机氮源 在上述试验基础上，按照氮等量原则，分别用硝酸铵和氯化铵替换基础培养基中的硫酸铵，每处理3个重复，于35 ℃、180 r/min下振荡培养72 h。

1.6 X4铁富集正交试验设计

在单因素试验的基础上，采用L18(37)正交试验表，对铁离子质量浓度、加铁时间、菌液接种量、培养时间及可溶性淀粉、酵母膏、氯化铵添加量7个因素进行3水平正交试验，正交试验因素与水平见表1。每处理3个重复，以铁富集率为指标，确定粪肠球菌X4菌株的最优富铁发酵条件组合。

表1 X4铁富集正交试验的因素与水平Table 1 Factors and levels of iron enrichment in X4 by orthogonal test

1.7 X4在最优条件下的15 L发酵罐模拟试验

以1.6节的优化条件进行15 L发酵罐模拟试验，装液量5 L。

1.8 测定指标与方法

1.8.1 菌体产量 培养结束后，收集培养液，于6 000 r/min离心10 min，弃去上清，用质量分数0.9%的生理盐水(去离子水配制)洗涤3次，获得菌体，于65 ℃烘箱中烘干至恒质量，即可得干菌体质量，最后求得菌体产量。

1.8.2 铁富集量与富集率 参照He等[9]的方法，取0.5 000 g干菌体，加入5 mL浓硝酸，同时滴加5滴体积分数30%的双氧水，于80 ℃条件下消化，消化残留物用1.4 mol/L的硝酸溶液溶解，再用去离子水定容至5 mL。用电感耦合等离子体光谱仪(ICP-OES)测定消化液中的铁含量，并计算菌体铁富集总量、铁富集量和铁富集率。

菌体铁富集总量(mg)=消化液中的铁含量(mg/L)×消化液体积(L)；

1.8.3 铁富集形态 参照张建萍等[10]提出的方法进行适当修改。取1.000 g微生物菌体，加5 mL去离子水，于超声波仪中破碎5 min，溶液流经D101大孔吸附树脂，用体积分数1%的HNO3按一定流速洗涤树脂，收集洗涤液，用电感耦合等离子体光谱仪(ICP-OES)测定其中铁含量，即为无机铁量，另外计算有机铁量和铁有机化率。

有机铁量(mg)=菌体铁总含量(mg)―无机铁量(mg)；

1.9 数据处理与分析

首先采用Excel 2013软件对原始试验数据进行处理，然后再采用SPSS 20.0软件进行分析，其中对单因素试验数据进行单因素方差分析，正交试验数据进行极差分析，显著水平为P<0.05。所有试验结果均采用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 粪肠球菌X4的生长曲线

由图1可知，接种培养14 h时,粪肠球菌X4菌株生长进入稳定期，随后6 h内保持稳定的生长量，这为加铁时间的设置提供了参考依据。

图1 粪肠球菌X4菌株的生长曲线Fig.1 Growth curve of Enterococcus faecalis X4

2.2 粪肠球菌X4铁富集条件的单因素优化

2.2.1 铁离子质量浓度对铁富集的影响 由图2可知，当培养液中铁离子质量浓度从0 mg/L增加至1 200 mg/L时，X4铁富集率和菌体产量呈现抛物线变化趋势；铁离子质量浓度为0～600 mg/L时，菌体产量和铁富集率均呈上升趋势，二者均在铁离子质量浓度为600 mg/L时达到最大；铁离子质量浓度超过600 mg/L时，菌体产量和铁富集率均呈下降趋势。可见，培养液中铁离子质量浓度为600 mg/L时，最适合X4诱变株的生长和铁富集。

2.2.2 加铁时间对铁富集的影响 由图3可知，加铁时间对X4诱变菌株的富铁性能有一定影响，随着加铁时间的延迟，X4菌体产量和铁富集率呈上升趋势，在培养12 h时加铁，其菌体产量和铁富集率均达到最高；超过12 h加铁，其菌体产量和铁富集率呈下降趋势。因此，选择在X4诱变菌株培养12 h时加铁，其菌体产量和铁富集率均最大。

2.2.3 接种量对铁富集的影响 由图4可知，随着菌液接种量的增加，菌体产量和铁富集率呈上升趋势，在X4菌液接种量为15%时，其菌体产量和铁富集率均达到最大；接种量超过15%后，其菌体产量与富铁率不再显著增加(P>0.05)。因此，选择菌液接种量为15%。

小图标处标不同小写字母表示处理间铁富集率或 菌体产量差异显著(P<0.05)，图3～5同 Different lowercase letters indicate significant differences in iron enrichment rate or cell yield (P<0.05).The same inFig.3-5图2 铁离子质量浓度对粪肠球菌X4铁富集和 菌体生长的影响Fig.2 Effect of iron concentration on iron enrichment and cell growth of Enterococcus faecalis X4

图3 加铁时间对粪肠球菌X4铁富集和菌体生长的影响Fig.3 Effect of iron concentration on iron enrichment and cell growth of Enterococcus faecalis X4

2.2.4 培养时间对铁富集的影响 由图5可知，随着培养时间的延长，X4菌体产量和铁富集率呈先上升后下降的趋势；在培养72 h时，其菌体产量和富铁率达到最高；之后随着培养时间的延长，其菌体产量与富铁率呈下降趋势，在培养96 h时其菌体产量与富铁率显著降低(P<0.05)。因此，X4菌株的最佳培养时间为72 h。

2.2.5 碳源种类对铁富集的影响 由图6可见，X4诱变菌株在以可溶性淀粉为碳源时发酵效果最好，其菌体产量最高，显著高于其他碳源(P<0.05)。

图5 培养时间对粪肠球菌X4铁富集和菌体生长的影响Fig.5 Effect of culture time on iron accumulation and cell growth of Enterococcus faecalis X4

由图6还可知，X4诱变菌株对其他碳源的发酵效果依次为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和乳糖。从铁富集率来看，也是以可溶性淀粉为碳源时X4诱变菌株铁富集率最高，其他依次为葡萄糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖。可见，以可溶性淀粉为碳源对X4诱变菌株的生长和铁富集效果最好。

2.2.6 有机氮源种类对铁富集的影响 由图7可知，以酵母膏为有机氮源时，菌体产量显著高于其他有机氮源(P<0.05)，然后依次为蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白胨。以酵母膏为有机氮源时铁富集率高于其他有机氮源(P<0.05)，然后依次为牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨。可见，酵母膏对X4诱变菌株富集铁最为有利。

2.2.7 无机氮源种类对铁富集的影响 由图8可知，以氯化铵为无机氮源时，菌体产量和铁富集率显著高于硝酸铵和硫酸铵(P<0.05)；硝酸铵组菌体产量高于硫酸铵组，但其铁富集率却低于硫酸铵组。

因此，选择氯化铵作为无机氮源。

图7 有机氮源种类对粪肠球菌X4铁富集和 菌体生长的影响Fig.7 Effects of organic nitrogen sources on iron accumulation and cell growth of Enterococcus faecalis X4

2.3 粪肠球菌X4铁富集条件的正交试验优化

由表2可知，影响X4铁富集率的因素依次为：A>E>F>D>G>B>C，即影响X4菌株铁富集率的因素依次为铁离子质量浓度、可溶性淀粉添加量、酵母膏添加量、培养时间、氯化铵添加量、加铁时间和X4接种量。由K值可得出各因素最佳水平组合为：A3B3C3D3E3F3G3，即铁离子质量浓度650 mg/L、加铁时间为发酵培养16 h、X4接种量18%、培养时间84 h、可溶性淀粉添加量20 g/L、酵母膏添加量15 g/L、氯化铵添加量4 g/L。在此最佳水平组合条件下进行验证试验，结果显示X4诱变菌株的单位菌体产量为5.52 g/L,铁富集率为86.16%。

2.4 粪肠球菌X4在最优条件下的发酵罐模拟试验

按照上述正交试验得到的最优条件组合，进行15 L发酵罐模拟试验，装液量为5 L。试验结果表明，在5 L培养液中加入3 250 mg铁(铁离子质量浓度650 mg/L)，X4菌株的铁富集量达2 800.2 mg，单位菌体铁富集量为101.38 mg/g，铁富集率86.16%，有机铁含量为350.03 mg，铁有机化率达12.5%，总菌体产量为27.62 g。

表2 粪肠球菌X4铁富集正交试验结果的极差分析Table 2 Range analysis of optimization results of orthogonal test for iron enrichment by X4

3 讨 论

铁是人体生命活动过程中所必需的微量元素之一，也是人类极易出现“隐性饥饿”的营养元素之一[11-12]。开发高效态有机铁制剂是解决铁缺乏的重要措施[13]，其中利用微生物强大的生命力和繁殖周期短的特点，对微量元素加以富集并转化为有机形式，是有机微量元素生产的重要方法之一[8]。目前，生物富集微量元素研究中主要以酵母菌为主，并陆续开发了酵母硒[14]、酵母铬[15]、酵母锌[16]等产品。此外，还有一些研究采用大型真菌富集微量元素以开发有机微量元素产品[17-19]，但尚未见采用粪肠球菌进行微量元素富集的相关报道。本试验系统研究了铁离子质量浓度、铁加入时间、X4菌液接种量、培养时间、碳源、氮源对粪肠球菌X4菌株铁富集的影响，结果表明对粪肠球菌X4富铁性能影响强度依次为铁离子质量浓度、可溶性淀粉添加量、酵母膏添加量、培养时间、氯化铵添加量、加铁时间和X4菌液接种量；各因素最佳水平组合为：铁离子质量浓度650 mg/L、加铁时间为培养16 h、X4菌液接种量18%、培养时间84 h、可溶性淀粉添加量20 g/L、酵母膏添加量15 g/L、氯化铵添加量4 g/L。15 L发酵罐模拟试验结果表明，单位菌体产量为5.52 g/L,单位菌体铁富集量为101.38 mg/g,铁富集率为86.16%。与已有文献报道的结果[20-21]相比，X4菌株在铁富集量和铁富集率方面均有所突破，结合其菌体产量来看，已经适合于工业化生产。

生物富集态微量元素的生产效率与菌体生物量、元素富集量和富集率等密切相关[22-23]。一般而言，微生物生长、繁殖等过程需要一定的微量元素，因此，在较低质量浓度下微量元素富集率普遍较高[24-25]。但生物富集态微量元素以菌体为利用方式，工业化生产时，不仅要求元素富集率高，也需要较高的菌体生物量和元素富集量。这就要求在微量元素质量浓度较高的发酵液中，微生物生长繁殖能力要强，且对元素的富集量要大。本研究所用粪肠球菌X4菌株是从猪粪便中筛选获得的，其原始菌株可在铁离子质量浓度为300 mg/L的培养基上生长；经过紫外线诱导筛选得到的粪肠球菌X4诱变菌株，其耐受铁离子质量浓度最高可达1 200 mg/L，这为高铁离子质量浓度下高效生产生物富集态铁制剂提供了条件。

此外，本试验对粪肠球菌X4诱变菌株铁制剂中的铁形态进行了初步研究，结果表明单位菌体中有机铁含量达12.67 mg/g，铁有机化率为12.5%。但对于工业化生产来说，一方面仍需要进一步提高其铁有机化率指标，另一方面需要对占富集量81.5%的其他铁进行赋存形态、稳定性及生物有效性研究，以保证粪肠球菌铁制剂的应用效果。

4 结 论

粪肠球菌X4诱变菌株为高耐铁菌株，可在铁离子质量浓度为1 200 mg/L的培养液中良好生长；影响粪肠球菌X4富铁性能的因素依次为铁离子质量浓度、可溶性淀粉添加量、酵母膏添加量、培养时间、氯化铵添加量、加铁时间和X4菌液接种量；在铁离子质量浓度650 mg/L、X4菌液接种量18%、可溶性淀粉添加量20 g/L、酵母膏添加量15 g/L、氯化铵添加量4 g/L、培养16 h加铁、培养84 h的条件下进行15 L发酵罐模拟试验，结果单位菌体铁富集量可达101.38 mg/g，铁富集率达86.16%，铁有机化率为12.5%。