磷肥对冷冻胁迫下紫花苜蓿根颈抗氧化特性的影响

陈卫东，张玉霞,丛百明，孙明雪，夏全超，张庆昕，杜晓艳

(1内蒙古民族大学 农学院，内蒙古 通辽 028041；2内蒙古通辽市畜牧兽医科学研究所，内蒙古 通辽 028000)

紫花苜蓿(MedicagosalivaL．)是豆科苜蓿属多年生牧草，有“牧草之王”的美称[1-2]，具有高产、适应性强、营养价值高等优良特性及保持水土、改良土壤等作用，是目前世界各地广泛种植的优质牧草[3]。近年来，在国家扶持政策和区域化农业布局优化调整的引导下，我国紫花苜蓿栽培面积突破历史新高，达到377万hm2，其中科尔沁沙地的紫花苜蓿生产也得以快速发展，成为新兴的紫花苜蓿优势生产区[4-5]。然而科尔沁沙地由于风沙大、降水量小、冬季极端低温、春季温度低等因素，不能保证紫花苜蓿安全越冬[6]，这严重限制了紫花苜蓿在当地的持续稳定生产[7-9]。目前通过增施磷肥提高植物抗氧化特性使抗寒性增强的研究较多[10-11]，有关苜蓿抗寒研究多集中在地上部分的生长与生理研究方面[12-13]，而关于磷肥在低温胁迫处理下对紫花苜蓿根颈抗氧化特性影响的报道较少[14-15]。为此，本试验采用大田试验对紫花苜蓿进行磷肥种类及其不同施用量处理，于越冬前期挖取紫花苜蓿越冬材料模拟低温胁迫，检测低温胁迫下紫花苜蓿根颈的抗氧化特性及可溶性蛋白(SP)含量，分析不同磷肥处理下紫花苜蓿越冬材料在低温胁迫下抗氧化特性的变化，明确在科尔沁沙地紫花苜蓿安全越冬的磷肥施用种类及施用量，为科尔沁沙地紫花苜蓿抗寒越冬提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古通辽市内蒙古民族大学科技示范园区(43°36′N，122°22′E)，年平均气温 6.4 ℃，≥10 ℃年活动积温3 184 ℃，年平均日照时数3 000 h，无霜期150 d，年平均降水量379.1 mm，蒸发量是降水量的5倍，年平均风速3～4 m/s，为典型的温带大陆性季风气候。试验田土壤为沙土，是新开垦的沙化草地，0～20 cm土层土壤pH值为8.3，土壤有机质含量6.4 g/kg，全氮含量0.36 g/kg，碱解氮含量35.37 mg/kg，速效钾含量77.51 mg/kg，速效磷含量3.70 mg/kg。

1.2 试验设计

供试苜蓿材料为‘公农1号’紫花苜蓿品种，种子购自北京百斯特草业有限公司。试验材料于2018-07-17播种，播种量22.5 kg/hm2，条播行距15 cm，播种前撒施氯化钾150 kg/hm2(K2O)，苜蓿生长过程中适时进行喷灌、除草、防治病虫害等田间管理。8月20日采用沟施方式施用不同种类和不同施用量的磷肥，磷肥种类为重过磷酸钙(P2O5含量为44%)和磷酸二铵(P2O5含量为46%)，施用量设0(对照，CK)，100，200，300，400 kg/hm25个磷肥(P2O5)施用水平。采用二因素随机区组试验设计，每个处理设3个重复，共30个小区，小区面积为4 m×5 m，四周设保护行。

于封冻期前(11月15日)取样，挖取苜蓿越冬器官，每小区取样50株(粗细均匀一致)，平均分成2份，其中1份置于4 ℃冰箱低温储存，另 1 份于程序式低温处理箱模拟低温处理。低温处理时采用脱脂棉包裹，加水适量，再用锡纸包裹，注明编号，以0 ℃为起点，以4 ℃/h 的速率降温，到达设定温度(-20 ℃)后保持6 h，然后按照4 ℃/h 的速率升温至4 ℃，取出置于4 ℃下保持12 h，然后进行抗氧化生理指标的测定。

1.3 测定指标及方法

参考文献[16]的方法测定生理指标，其中丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸比色法，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚比色法，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑比色法，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法，可溶性蛋白(SP)含量测定采用考马斯亮蓝比色法。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2010进行数据处理，结果用“平均值±标准差”表示，用DPS软件进行二因素试验统计分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 磷肥对紫花苜蓿根颈MDA含量的影响

如表1所示，在低温冷藏(4 ℃)条件下，随着2种磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根颈MDA含量呈先降低后升高的趋势，均在300 kg/hm2(P2O5)处理下MDA含量最低，且显著低于不施磷肥和施用100 kg/hm2(P2O5)处理(P<0.05)；在100，200，300 kg/hm2(P2O5)处理下，施用重过磷酸钙的紫花苜蓿根颈MDA含量显著低于施用磷酸二铵(P<0.05)。

低温冷冻(-20 ℃)条件下，施用0，100，200，300，400 kg/hm2重过磷酸钙处理的紫花苜蓿根颈MDA含量，分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加了104.67%，131.67%，143.64%，23.40%和56.86%；施用0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二铵处理的紫花苜蓿根颈MDA含量，分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加了104.67%，51.04%，70.77%，47.92%和33.93%，说明低温冷冻导致膜脂过氧化严重。

在低温冷冻条件下，2种磷肥不施肥处理的紫花苜蓿MDA含量显著高于各施肥处理(P<0.05)，施用300和400 kg/hm2(P2O5)处理的MDA含量显著低于施用100和200 kg/hm2(P2O5)处理(P<0.05)，说明秋季施用磷肥能够提高紫花苜蓿的抗寒性，施用量以300～400 kg/hm2(P2O5)为宜。

表1 不同磷肥种类及施用量下紫花苜蓿根颈MDA含量的变化Table 1 Changes of MDA content in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers nmol/g

2.2 磷肥对紫花苜蓿根颈SOD活性的影响

表2显示，在低温冷藏(4 ℃)条件下，随着2种磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根颈SOD活性呈先增强后减弱的趋势，均在300 kg/hm2(P2O5)处理下达到最强，且显著高于其他处理(P<0.05)；在100，200，300，400 kg/hm2(P2O5)处理下，施用重过磷酸钙的紫花苜蓿根颈SOD活性显著高于施用磷酸二铵(P<0.05)。

在低温冷冻(-20 ℃)条件下，施用0，100，200，300，400 kg/hm2重过磷酸钙处理的紫花苜蓿根颈SOD活性，分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加了12.71%，8.99%，12.43%，29.26%和25.30%；施用0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二铵处理的紫花苜蓿根颈SOD活性，分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加了12.71%，5.64%，9.07%，34.12%和73.69%，说明低温冷冻导致活性氧大量产生，紫花苜蓿根颈通过增强SOD活性清除活性氧。

在低温冷冻条件下，施用100～300 kg/hm2重过磷酸钙处理的紫花苜蓿根颈SOD活性，显著高于对应的磷酸二铵处理(P<0.05)；在2种磷肥处理下，200～400 kg/hm2(P2O5)处理紫花苜蓿根颈SOD活性显著高于不施磷肥处理(P<0.05)。说明秋季施用磷肥能够提高低温冷冻条件下紫花苜蓿的SOD活性，且重过磷酸钙的作用强于磷酸二铵，施用量为300 kg/hm2(P2O5)时SOD活性最强。

表2 不同磷肥种类及施用量下紫花苜蓿根颈SOD活性的变化Table 2 Changes of SOD activity in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers U/g

2.3 磷肥对紫花苜蓿根颈POD活性的影响

表3显示，在低温冷藏(4 ℃)条件下，随着2种磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根颈POD活性呈先增强后减弱的趋势，均在300 kg/hm2(P2O5)处理下达到最强，且显著高于其他处理(P<0.05)；在施用100，200，300，400 kg/hm2(P2O5)处理下，施用重过磷酸钙的紫花苜蓿根颈SOD活性显著高于施用磷酸二铵(P<0.05)。

表3 不同磷肥种类及施用量下紫花苜蓿根颈POD活性的变化Table 3 Changes of POD activity in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers U/(min·g)

在低温冷冻(-20 ℃)条件下，各施肥处理的紫花苜蓿根颈POD活性较低温冷藏处理增强，说明低温冷冻导致过氧化物大量产生，紫花苜蓿通过增强POD活性提高抗氧化特性。

在低温冷冻条件下，施用200～400 kg/hm2重过磷酸钙处理的紫花苜蓿根颈POD活性,显著高于相同施用量的磷酸二铵处理(P<0.05)；在2种磷肥处理下，施用100，200，300，400 kg/hm2处理的紫花苜蓿根颈POD活性显著高于不施肥处理(P<0.05)，施用300 kg/hm2(P2O5)处理的紫花苜蓿根颈POD活性显著高于其他处理(P<0.05)。说明秋季施用磷肥能够提高苜蓿在低温冷冻条件下的POD活性，且施用重过磷酸钙的效果优于磷酸二铵，施用量以300 kg/hm2(P2O5)下POD活性最强。

2.4 磷肥对紫花苜蓿根颈CAT活性的影响

由表4可见，在低温冷藏(4 ℃)条件下，随着2种磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根颈CAT活性呈先增强后减弱的趋势，在300 kg/hm2(P2O5)处理下紫花苜蓿根颈CAT活性最强，且显著高于除400 kg/hm2(P2O5)处理外的其他处理(P<0.05)；在施用300 和400 kg/hm2(P2O5)处理下，施用重过磷酸钙的紫花苜蓿根颈CAT活性显著高于施用磷酸二铵(P<0.05)。

在低温冷冻(-20 ℃)条件下， 0，100，200，300 kg/hm2重过磷酸钙处理紫花苜蓿根颈CAT活性，分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加22.23%，23.78%，8.20%和8.16%；0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二铵处理紫花苜蓿根颈CAT活性，分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加22.23%，27.18%，13.32%，11.50%和16.21%，说明低温冷冻导致CAT大量产生，苜蓿通过增强CAT活性来提高抗氧化能力。

在低温冷冻条件下，100，200，300，400 kg/hm2磷肥处理的紫花苜蓿根颈CAT活性显著高于不施肥处理(P<0.05)，施用300 kg/hm2处理显著高于其他处理(除磷酸二铵的400 kg/hm2处理外)(P<0.05)，说明秋季施用磷肥能够提高苜蓿在低温冷冻条件下的CAT活性，施用量以300 kg/hm2下CAT活性最强。

表4 不同磷肥种类及施用量下紫花苜蓿根颈CAT活性的变化Table 4 Changes of POD activity in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers U/(min·g)

2.5 磷肥对紫花苜蓿根颈SP含量的影响

表5显示，在低温冷藏(4 ℃)条件下，随着2种磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根颈SP含量呈先升高后降低的趋势，均以300 kg/hm2(P2O5)处理紫花苜蓿根颈SP含量最高，且显著高于其他处理(P<0.05)；在施用300和400 kg/hm2(P2O5)处理下，施用重过磷酸钙的紫花苜蓿根颈SP含量显著高于施用磷酸二铵处理(P<0.05)。

在低温冷冻(-20 ℃)条件下，0，100，200，300，400 kg/hm2重过磷酸钙处理紫花苜蓿根颈SP含量,分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加20.91%，2.97%，20.12%，6.56%和12.84%;0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二铵处理紫花苜蓿根颈SP含量,分别较低温冷藏(4 ℃)条件下增加20.91%，16.44%，27.75%，7.38%和20.11%，说明低温冷冻下苜蓿通过提高SP含量增强抗寒性。

在冷冻条件下，施用100，200，300，400 kg/hm2(P2O5)处理(除100 kg/hm2重过磷酸钙处理外)的紫花苜蓿根颈SP含量显著高于不施肥处理(P<0.05)，且2种肥料均以300 kg/hm2(P2O5)处理的SP含量最高，说明秋季施用磷肥能够提高苜蓿在低温冷冻条件下的SP含量，施用量以300 kg/hm2(P2O5)效果最好。

表5 不同磷肥种类及施用量下紫花苜蓿根颈SP含量的变化Table 5 Changes of SP content in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers mg/g

2.6 紫花苜蓿根颈MDA含量与抗氧化酶活性及SP含量的相关性

表6显示，在低温冷藏(4 ℃)条件下，重过磷酸钙处理的紫花苜蓿根颈MDA含量与POD活性、SP含量呈显著负相关(P<0.05)；磷酸二铵处理的紫花苜蓿根颈MDA含量与CAT活性、SP含量呈极显著负相关(P<0.01)，与POD、SOD活性呈显著负相关(P<0.05)。在-20 ℃低温冷冻条件下，重过磷酸钙处理的紫花苜蓿根颈MDA含量与CAT活性、SP含量呈显著负相关(P<0.05)，与POD、SOD活性呈极显著负相关(P<0.01)；磷酸二铵处理的紫花苜蓿根颈MDA含量与POD、SOD活性呈显著负相关(P<0.05)，与CAT活性、SP含量呈极显著负相关(P<0.01)。表明POD、SOD、CAT活性及SP含量越高，MDA含量越低，紫花苜蓿根颈受伤程度越轻，磷肥能够提高苜蓿在低温冷冻条件下的抗氧化酶活性，抑制膜脂过氧化，提高苜蓿抗寒性。

表6 紫花苜蓿根颈中MDA含量与抗氧化酶活性及SP含量的相关性Table 6 Correlation between MDA and antioxidant enzyme activities and SP content in alfalfa root neck

3 讨 论

苜蓿根颈是豆科牧草重要的营养运输器官，其受伤害程度直接影响牧草抗寒能力的强弱[17-18]。MDA是膜脂过氧化的产物之一，其含量反映了脂质过氧化强度和膜系统受伤害程度及对逆境环境的响应程度，是逆境生理中的一个重要指标[19-20]。李婷等[15]研究表明，随着低温胁迫的逐渐增强，紫花苜蓿根颈中的MDA含量有增加趋势，导致其含量增加的最主要原因是：随着温度的下降，紫花苜蓿根颈受到伤害，导致膜脂过氧化加重，细胞膜受到损伤，膜脂过氧化产物MDA含量升高。本研究结果表明，与低温冷藏相比，低温冷冻条件下紫花苜蓿MDA含量升高，施磷肥处理紫花苜蓿根颈MDA含量显著低于不施磷肥处理(P<0.05)，且在300 kg/hm2(P2O5)处理下MDA含量最低。说明在科尔沁地区秋季施用磷肥有利于降低苜蓿根颈受伤害程度，对苜蓿安全越冬起到促进作用。

SOD、POD、CAT是植物体内重要的抗氧化酶和细胞膜保护酶系统，逆境条件下这些保护酶能够及时清除植物体内多余的氧自由基，保护细胞膜尽可能少受外界低温破坏，从而增强植物的抗寒性[21]。李婷等[15]研究表明，在封冻期(11月20日以后)随着磷肥用量增加，紫花苜蓿根颈抗氧化酶活性呈现逐渐降低趋势，认为秋季施用过量磷肥会降低紫花苜蓿根颈的抗寒能力，在施用重过磷酸钙159.1 kg/hm2(P2O5)时抗氧化酶活性最强。本试验结果表明，随着磷肥用量的增加，低温冷藏与低温冷冻条件下紫花苜蓿根颈抗氧化酶活性均呈现先增加后降低的趋势，在施用重过磷酸钙300 kg/hm2(P2O5)时抗氧化酶活性最强，这与李婷等[15]所得结果不同，出现这种差异的原因是本试验没有将磷肥作为种肥施入。侯立刚等[22]研究表明，低温胁迫下，水稻叶片抗氧化酶活性明显升高，适当增磷后，水稻叶片的抗氧化酶活性均高于未施磷处理；随着施磷量增加，水稻叶片抗氧化酶活性上升幅度明显增加，这与本试验结果相同，说明施磷可以增强苜蓿低温胁迫下清除活性氧的能力。本试验结果表明，紫花苜蓿秋季施用300 kg/hm2磷肥的处理，在低温胁迫下根颈SOD、POD和CAT活性最高，清除活性氧能力最强，且施用重过磷酸钙的效果优于施用磷酸二铵。

可溶性蛋白(SP)是重要的渗透调节物质，植物通过渗透调节作用积累有机酸、糖类和蛋白等小分子有机物，使低温条件下细胞维持一定的膨压，减少细胞水分的流失, 避免因结冰引起的伤害[23-25]。柯野等[26]研究表明，随着施磷量的增加，甘蔗叶片中SP含量呈现先升高后降低的变化趋势，导致这种变化的原因是，适当使用磷肥可以促进甘蔗叶片保持良好的渗透调节作用，而过量施用磷肥会对SP含量产生抑制作用，前人在对马尾松[27]、小麦[28]、大蒜[29]的研究中也得到了同样的结果，这与本试验结果相同，即在低温冷藏与低温冷冻条件下，增施磷肥的各处理紫花苜蓿根颈SP含量均升高，在施用重过磷酸钙300 kg/hm2(P2O5)时SP含量最高。

4 结 论

重过磷酸钙通过增强低温驯化期紫花苜蓿根颈POD活性和SP含量，极显著提高冷冻处理下紫花苜蓿根颈的SOD、POD活性及显著提高CAT活性和SP含量，从而实现对活性氧的清除，提高紫花苜蓿的抗氧化和渗透调节能力；磷酸二铵则通过极显著提高低温驯化期及冷冻期紫花苜蓿根颈CAT活性和SP含量、显著提高SOD和POD活性，从而提高紫花苜蓿的抗氧化能力，降低MDA含量，增强渗透调节能力，提高苜蓿抗寒性。增施磷肥可提高苜蓿的抗寒性，其中重过磷酸钙对苜蓿抗寒性的增强效果优于磷酸二铵，以300 kg/hm2(P2O5)处理效果最佳。