高效液相色谱法测定4种乌头中药中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱

梁嘉豪,路晓君,师燕华,王 涛,胡 萌,贠克明,崔海燕

(山西医科大学法医学院毒物分析教研室,晋中 030600;*通讯作者,E-mail:hycui1985@126.com)

乌头属中药在中国和其他一些亚洲国家被广泛用于治疗多种疾病[1-3],尤其在我国分布较广泛[4]。研究表明其具有抗炎、镇痛和抗风湿等药理特性[1,5]。川乌、草乌等作为中医临床常用中药,具有良好的药效,也常用于治疗风寒湿痹、关节疼痛麻木、心腹冷痛、寒疝等症[6]。乌头类中药中含有剧毒成分,其中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱这3种物质既是有效成分,又是毒性成分[7]。由于其良好的药理活性,民间常自行炮制药酒,导致自杀、他杀行为以及服药过量导致中毒死亡案件时有发生;另外乌头碱在体内吸收代谢迅速,形同隐形杀手,给法医鉴定带来了很大的困难[8]。同时其治疗量与中毒量非常接近[9],导致中医临床安全用药受限。目前采用高效液相色谱法分别检测4种乌头属中药中乌头生物碱含量已有文献报道[10-12],但将这4种乌头属中药同时测定进行含量测定比较的未见报道。因此本研究通过对4种乌头属中药中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量测定比较,不仅可以为有效评价及控制中药及炮制品的质量和保证临床用药的安全性提供理论依据,还可为有关乌头属中药中毒的科学研究和法医学鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

1260高效液相色谱仪(美国AgiLent公司)包括安捷伦色谱工作站和紫外检测系统、电子天平(德国赛多利斯Sartorius)、超声波清洗机(宁波新芝生物技术股份有限公司)、MiLLiporeSimpLicity185超纯水系统(美国Millipore公司)、中药粉碎机(郑州科丰仪器设备有限公司)、旋转蒸发仪(德国IKA公司)。

生川乌、制川乌中药材(四川江油中坝附子科技发展有限公司),草乌、制草乌中药材(安徽济顺中药饮片有限公司);标准品乌头碱、新乌头碱、次乌头碱(四川省维克奇生物科技有限公司);乙腈为色谱纯,研究用水为超纯水,研究中的所有其他试剂为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱的选择:ZORBAX Eclipse Plus C18柱,流动相A:10 mmol/L乙酸铵水溶液,流动相B:乙腈(72 ∶28),等度洗脱模式,流速:1.5 ml/min,柱温:35 ℃,检测波长:232 nm,进样量:10 μl。

1.3 溶液制备

1.3.1 标准品溶液制备 取一定量的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱标准品,经过精密称量后分别取1 mg,各置于1.5 ml离心管中,并各加1 ml乙腈溶液于离心管中定容,摇匀,得浓度为1 mg/ml的标准品母液。

1.3.2 待测样品溶液制备 取4个批次的乌头类药材生川乌、生草乌、制川乌和制草乌,分别于粉碎机中粉碎后过60目筛,装于自封袋中密封好。各取1 g生川乌、生草乌、制川乌、制草乌的粗粉放于50 ml离心管中,一式三份,然后各加入15 ml的25%氨水,精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1 ∶1)混合溶液25 ml,称定其质量,生川乌分别为35.8,35.5,35.4 g,生草乌分别为35.1,35.7,35.1 g,制川乌分别为34.8,35.4,35.3 g,制草乌分别为35.3,35.3,35.1 g,在功率为300 W,频率为40 kHz,水温在25 ℃的条件下进行超声处理30 min,再次称定质量,减失的质量用异丙醇-乙酸乙酯(1 ∶1)混合溶液补足,摇匀,用滤纸进行过滤。精密量取续滤液15 ml,在旋转蒸发仪上38 ℃浓缩至干,剩余残渣中精密加入乙腈溶液1.5 ml溶解,取滤液,得待测样品溶液。

1.3.3 待测样品含量测定 采用1260高效液相色谱仪在“1.2”色谱条件下和“1.3.2”待测样品制备下,对4种乌头属中药中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量进行测定。

1.4 方法学验证

采用1260高效液相色谱仪在“1.2”色谱条件下和“1.3”待测样品制备下,对4种乌头属中药中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量测定进行标准曲线及线性、精密度、稳定性和重复性的考察。

1.4.1 标准曲线考察 精密量取浓度为500 μg/ml的混合标准品溶液,分别稀释成浓度为2.5,5,10,25,50,100,200,250 μg/ml的混合标准品溶液,各置于1.5 ml进样瓶中,在“1.2”的色谱条件下,进行测定。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标建立3种生物碱的标准曲线方程。

1.4.2 精密度考察 精密吸取浓度为500 μg/ml的混合标准品溶液,稀释成浓度为5,50,200 μg/ml的混合标准品溶液,分别置于1.5 ml进样瓶中,在“1.2”的色谱条件下,连续重复进样3次,进行精密度考察。

1.4.3 稳定性考察 精密量取浓度为500 μg/ml的混合标准品溶液,分别稀释成浓度为5,50,200 μg/ml的混合标准品溶液,各置于1.5 ml进样瓶中,在“1.2”的色谱条件下,分别在24,48,72 h时进样,考察稳定性。

1.4.4 重复性考察 精密量取“1.3.2”中制备而成的待测样品溶液1 ml,分别置于1.5 ml进样瓶中,在“1.2”的色谱条件下,平行3次进样,进行测定。

2 结果

2.1 色谱图

在“1.2”的色谱条件下，标准品溶液和待测样品生川乌溶液中3种生物碱峰都能得到很好的分离效果，标准品溶液中次乌头碱、新乌头碱、乌头碱的保留时间分别为14.293,18.063,20.306 min(见图1)。生川乌溶液中次乌头碱、新乌头碱、乌头碱的保留时间分别为13.960,17.742,20.052 min(见图2)。

图1 标准品色谱图Figure 1 The HPLC of standard products

图2 生川乌溶液中色谱图Figure 2 The HPLC of wild aconite roots

2.2 标准曲线及线性方程

三种生物碱化合物中，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的回归方程在2.5-250 μg/ml浓度范围内，线性关系良好(见表1)。

表1 三种生物碱的线性方程及线性范围Table 1 The linear equations and linear range of the three alkaloids

2.3 精密度

乌头碱、新乌头碱和次乌头碱这3种有效成分的RSD值满足RSD<15%的要求[13](见表2),表明本研究的精密度良好。

表2 方法精密度的考察Table 2 The precision of the established method

2.4 稳定性

乌头碱、新乌头碱、次乌头碱RSD值满足RSD<15%的要求[13],结果表明三种物质在72 h内稳定性良好(见表3)。

表3 方法稳定性的考察Table 3 The stability the established method

2.5 样品含量测定

按照回归方程进行3批次样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量的测定,结果表明在4种乌头属中药中只有生川乌中含有3种乌头生物碱成分(见表4)。

表4 四种乌头属中药中3种生物碱的含量Table 4 The contents of three alkaloids in four kinds of aconitine

2.6 重复性

由上述“2.5”得出,仅生川乌中含有3种乌头生物碱成分,因此对其进行重复性考察。同一批次样品,平均分成3份,平行测定。测得乌头碱、新乌头碱、次乌头碱3种有效成分含量的RSD值满足RSD<15%的要求[13](见表5),结果表明所测定条件的重复性良好。

表5 生川乌中3种生物碱含量Table 5 The content of three alkaloids in Radix Aconitae

3 讨论

3.1 流动相的选择

在流动相的选择上本研究分别进行了水:甲醇、水:乙腈、0.1%三乙胺水溶液:甲醇、0.1%三乙胺水溶液:乙腈、10 mmol/L乙酸铵水溶液:乙腈,上述5组流动相溶液系统的色谱分析,结果表明采用水:甲醇、水:乙腈、0.1%三乙胺水溶液:甲醇、0.1%三乙胺水溶液:乙腈作为流动相时,3种生物碱色谱峰分离效果不佳;采用10 mmol/L乙酸铵水溶液:乙腈作为流动相时,3种生物碱可以达到完全的分离效果,用时较短,且系统分离效果良好[14]。因此研究中采用10 mmol/L乙酸铵水溶液:乙腈作为本研究的流动相。

3.2 定容溶剂的选择

本研究分别考察了甲醇溶液和乙腈溶液对样品分析的影响。结果表明甲醇溶液定容效果不如乙腈溶液佳,乙腈溶液溶解效果更好,溶剂效应低,因此选择乙腈溶液作为定容溶剂。

3.3 色谱柱的选择

研究中考察了ZORBAX Eclipse Plus C18和ZORBAX Eclipse XDB-C18两种色谱柱的性能。结果表明,使用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱时,能使出峰时间提前,并使3种乌头生物碱达到完全分离的目的,因此选用ZORBAX Eclipse Plus C18柱作为本研究的色谱柱。

3.4 洗脱的方式

洗脱方式是影响色谱分离的重要因素之一,本研究中分别考察了梯度洗脱与等度洗脱两种方式。结果表明,梯度洗脱分离效果较差,3种物质的色谱峰无分离或没有达到完全分离;而以等度洗脱的方式进样时,发现3种物质的色谱峰分离效果较梯度洗脱好,且达到了良好的分离效果,最后考察了不同比例的等度洗脱方式10 mmol/L乙酸铵水溶液 ∶乙腈(50 ∶50,45 ∶55,60 ∶40,65 ∶35,70 ∶30),发现等度洗脱方式10 mmol/L乙酸铵水溶液 ∶乙腈在70 ∶30处有较为良好的分离效果,最后经逐级优化发现等度洗脱比例为10 mmol/L乙酸铵水溶液 ∶乙腈为72 ∶28时,洗脱效果最佳。故选择此洗脱比例方式。

3.5 检测波长的选择

由于测定时所使用的待测样品中通常含有最大吸收波长各不相同的多种化合物,因此检测的灵敏性尤为重要,应选择样品溶液中大多数化合物均有的吸收波长去记录图谱。研究中发现,3种生物碱在220-240 nm范围内的紫外吸收较强,综合考虑了HPLC洗脱中基线的漂移等因素,最后选择232 nm作为本研究的检测波长。

3.6 流速的选择

确定以10 mmol/L乙酸铵水溶液 ∶乙腈=72 ∶28作为流动相与洗脱方式的条件下,分别考察了流速为0.8,1.0,1.5 ml/min时色谱峰的保留时间。结果表明,在流速为1.5 ml/min的情况下,3种生物碱的色谱峰分析时间较短,故综合考虑选择1.5 ml/min作为进样流速。

3.7 临床应用价值

乌头类中药中含有多种生物碱成分,而其中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱既是主要活性成分,同时也是毒性成分。在选取的4种中药材中,制川乌和制草乌分别为生川乌和生草乌的炮制品,使用建立的方法分别对生川乌、生草乌、制川乌、制草乌4种乌头中药进行了含量测定,结果表明生川乌中3种生物碱均含有,且新乌头碱含量最高,其次为次乌头碱、乌头碱。而生川乌、制草乌、制川乌未完全都测定出3种生物碱,考虑可能与药材的产地、采摘时间以及炮制方法不同等因素有关。结果还表明,生川乌和生草乌中3种主要生物碱的含量都较对应炮制品高,故如何炮制使其生药中毒性含量降低,达到稳定、可控,是保证临床上用药安全与有效的关键因素[15]。

3.8 法医学鉴定意义

乌头属中药中3种乌头生物碱活性成分毒性剧烈,中毒量与治疗量非常接近[9],除了误食、误用造成中毒原因外,还有些不法分子以此类中药投毒导致他杀事件的发生,且因其毒性大,在体内代谢较快,给案件的侦查带来了很大的挑战。本研究选用的4种乌头属中药中仅有生川乌中3种乌头生物碱成分均含有。基于此,在后续开展的有关乌头碱中毒的法医毒物分析研究中,动物实验的灌胃药材我们选用生川乌。通过研究乌头生物碱在中毒动物体内的法医毒物动力学规律,从而为此类中药中毒的法医学案件侦破提供提供参考依据。