大麻素1型受体过表达对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠神经干细胞的影响

潘晶晶 邹蕾 黄志远 孙香蕾

摘要 目的：探讨大麻素1型受体（CB1R）过表达对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脑神经干细胞的影响。方法：建立EAE小鼠模型（n=50）并设置佐剂组（n=10）和对照组（n=10），建模成功的EAE小鼠注射CB1R过表达慢病毒液并记为CBlR过表达组（n=20），设置空载体组（n=10）和EAE模型组（n=20）。评价各组小鼠神经功能，观察对照组、EAE模型组和CBlR过表达组小鼠的脑组织病理学变化，检测脑组织CB1R、室管膜下区Brdu和Brdu+/Nestin+以及Sox-2 mRNA水平。结果：EAE模型组神经功能评分升高、CBlR蛋白降低（P<0.05），CBlR过表达组神经功能评分下降、CBlR蛋白升高（P<0.05）。EAE模型组脑组织出现炎症细胞浸润及髓鞘缺失等典型病理变化，CBlR过表达组的病理损伤显著改善。EAE模型组Brdu、Brdu+/Nestin+阳性细胞以及Sox-2mRNA水平均显著增加（均P<0.05），CBlR过表达组比较EAE模型组亦显著增加（P<0.05）。结论：过表达CBlR可能是通过加速小鼠脑神经干细胞的增殖从而促进脑组织损伤的修复，最终有效减轻了自身免疫性脑脊髓炎小鼠的症状。

关键词 大麻素1型受体;过表达;实验性自身免疫性脑脊髓炎;小鼠;脑组织室管膜下区;神经干细胞;5-溴-2′-脱氧尿苷;巢蛋白

Abstract Objective：To investigate the effect of cannabinoid 1 receptor（CB1R） overexpression on cerebral nerve stem cells in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods：EAE models（50 mice） were established，as well as an adjuvant group of 10 and a control group of 10 mice.In the models built successfully，EAE mice were injected with CB1R overexpression lentivirus and recorded as CBlR overexpression group（20 mice）.Null vector group（10 mice） and the EAE model group（20 mice） were also set.Neurological functions of mice in each group were evaluated，pathological changes of brain tissue were observed，and levels of CB1R，Brdu and Brdu+/Nestin+ in subependymal area and SOX-2 mRNA of brain tissue were detected.Results：In the EAE model group，neurological function score increased and CBlR protein decreased（P<0.05），while neurological function score decreased and CBlR protein increased in the CBlR overexpression group（P<0.05）.Typical pathological changes，such as inflammatory infiltration and myelin loss，occurred in the EAE model group.Pathological damage was significantly improved in the CBlR overexpression group.The levels of Brdu，Brdu+/Nestin+ positive cells and SOX-2 mRNA in the EAE model group were significantly increased（P<0.05），and so were the other two groups（P<0.05）.Conclusion：Overexpression of CBlR may promote the repair of brain tissue damage by accelerating the proliferation of brain neural stem cells in mice，and effectively alleviate the symptoms of autoimmune encephalomyelitis in the end.

Keywords Cannabinoid 1 receptor; Overexpression; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Mice; Subependymal area of brain tissue; Neural stem cells;5-bromo-2′-deoxyuridine; Nestin

中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.016

作为一种中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）疾病，多发性硬化（Multiple Sclerosis，MS）的主要病理特点为髓鞘脱失、炎症损伤且伴发轴索的丢失。其发病机制目前尚不完全明确，但免疫调节功能异常被认为与该病密切相关[1-3]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE）的病理及免疫特征与多发性硬化相似，因而常被作为最经典的动物模型广泛用于多发性硬化的基础研究[4-5]。具有自我更新并长期保持多项分化潜能的神经干细胞（Neural Stem Cells，NSCs）经过一定条件的诱导可增殖分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元细胞[6]。内源性大麻素、大麻素受体（Cannabinoid Receptor，CBR）、调节大麻素合成、转运及失活的相关蛋白、酶类均为内源性大麻素系统（Endocannabinoid System，ECS）的主要组成部分。ECS被认为可抑制神经兴奋性毒性，参与免疫炎症反应，进而维持中枢神经系统微环境的稳定，最终起到保护神经的作用[7]。大麻素1型受体（CB1R）和大麻素2型受体（CB2R）是大麻素受体的2种类型，均为G蛋白偶联受体[8]。以往研究证实内源性大麻素系统功能失调发生于多发性硬化中，而CB1R是目前被公认且研究较多的大麻素受体类型。本研究通过构建过表达CB1R的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型，观察小鼠脑组织神经干细胞标志物5-溴-2′-脱氧尿苷（5-bromo-2′-deoxyuridine，Brdu）、神经上皮前体细胞中的一种中间丝蛋白巢蛋白（Nestin）以及转录因子Sox-2的变化，探讨CB1R对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠脑神经干细胞的影响及对该病的可能保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取70只6～8周龄健康雌性C57B/L6小鼠，22～25 g/只，采购于斯贝福（北京）生物技术有限公司[动物许可证号：SCXK（京）-2019-0010]，实验前于20～24 ℃室温下适应性饲养1周，其间让小鼠自由饮水进食。

1.1.2 试剂与仪器 MOG35-55肽段（北京联科生物公司，货号：FS1061）;完全弗氏佐剂（CFA）（Sigma公司，美国，货号：F5881）;百日咳毒素（PTX）（Enzo Life Sciences公司，美国，货号：BML-G100-0050）;过表达CB1R慢病毒及空载体对照由上海吉凯设计并构建;Anti-Cannabinoid Receptor I抗体（兔多克隆抗体to Cannabinoid Receptor I，Abcam公司，美国，货号：ab23703）;Anti-BrdU抗体[BU1/75（ICR1）]（HRP，Abcam公司，美国，货号：ab220507）;Anti-Nestin抗体（EPR22023，Abcam公司，美国，货号：ab221660）;驴抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）预吸附二抗（Abcam公司，美国，货号：ab150153）;山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647）预吸附二抗（Abcam公司，美国，货号：ab150083）;垂直电泳仪、转膜仪（BioRad公司，美國，型号：1658003）;酶标仪（BioTek公司，美国，型号：synergy2）;光学显微镜（Olympus公司，日本，型号：BX51F32H01）;实时荧光定量PCR仪（ABI公司，美国，型号：7500Fast）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 所有小鼠分为5组，分别是EAE模型组、佐剂组、对照组、CBlR过表达组和空载体组。取3 mg MOG35-55肽段溶于1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，另取3 mg结核菌素溶于1 mL完全弗氏佐剂中，各取相同体积的2种溶液置于针管中，充分混合使其成油包水乳白色混悬液，静置无分层即为合格的MOG35-55抗原混悬液。

建模方法：1）EAE模型组（20只）：以每只C57B/L6小鼠200 μL的剂量于其背部脊柱两侧分4点注射，同时以200 ng/只的剂量尾静脉注射百日咳毒素（PTX），为加强免疫，48 h后腹腔注射相同剂量的百日咳毒素（PTX）。2）佐剂组（10只）：混悬液中用1 mL PBS取代MOG35-55，免疫方法与EAE模型组相同。3）对照组（10只）：仅注射相同体积的生理盐水。4）CBlR过表达组（20只）：建模成功的EAE小鼠注射CB1R过表达慢病毒液。5）空载体组（10只）：注射相同体积的携带空载体的慢病毒液。

1.2.2 干预方法 取建模成功的EAE小鼠30只随机分为2组，CBlR过表达组（n=20）：发病当天于EAE小鼠L4/5间隙注射过表达CB1R慢病毒液;空载体组（n=10）：发病当天于EAE小鼠L4/5之间注射相同体积的携带空载体的慢病毒液。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 神经功能学评分 从免疫当天开始至免疫后第28天对空载体组、佐剂组、对照组、EAE模型组及CBlR过表达组小鼠进行神经功能评分：无症状记0分;垂尾记1分;轻微后肢无力、行路不稳及翻正反射迟钝记2分;后肢麻痹和（或）前肢力弱记3分;前肢麻痹记4分;四肢瘫记5分;濒临死亡或死亡记6分。

1.2.3.2 Western Blotting检测CB1R蛋白表达 免疫后第28天将对照组、EAE模型组及CBlR过表达组小鼠处死并取其大脑组织，用动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白含量。将制备的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，之后转模至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室温下加含5%BSA的封闭液作用2 h，加入用封闭液稀释的兔抗小鼠CB1R一抗，置于4 ℃冰箱过夜。次日取出复温，加适量PBST洗膜3次，10 min/次，再加稀释好的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温震荡孵育1 h，PBST洗膜，干净后加ECL显色，暗室曝光拍照，同时以GAPDH作为内参蛋白。

1.2.3.3 HE染色和WEIL染色观察组织病理学变化 将对照组、EAE模型组及CBlR过表达组小鼠处死后取其脊髓腰膨大处组织，4%甲醛溶液固定后，依次经石蜡包埋、切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水等步骤，分别经苏木精-伊红（HE）染色和WEIL染色，二甲苯透明后用中性树胶封片，置于光学显微镜下观察组织病理学变化以及髓鞘脱失情况。

1.2.3.4 免疫组织化学法检测脑组织室管膜下区Brdu的表达 处死对照组、EAE模型组及CBlR过表达组小鼠。用生理盐水将Brdu稀释成20 mg/mL的溶液，于小鼠被处死前2 d以100 mg/kg的剂量进行腹腔注射，1次/d，连续2 d。第3天腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，沿肋骨内缘切开横膈以使心脏暴露，经左心室将注射器刺入主动脉，剪开右心耳，灌注生理盐水至流出液清亮后，再先快后慢灌注4%多聚甲醛至小鼠尾巴、四肢僵直，1 h后将脑组织取出后置于4%的多聚甲醛溶液4 ℃固定48 h，然后用30%蔗糖进行脱水处理48 h，于冰冻切片机连续切片，防冻液中-20 ℃保存备用。经磷酸盐缓冲液（PBS）静置水化及冲洗，加封闭液室温作用1 h，加稀释好的大鼠抗Brdu单克隆抗体4 ℃过夜，次日，PBST洗涤，再加稀释好的驴抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）预吸附二抗孵育，PBST洗涤，加防荧光衰减剂并封片，置于荧光显微镜下观察。

1.2.3.5 免疫荧光检测脑组织室管膜下区Brdu+/Nestin+的表达 取对照组、EAE模型组及CBlR过表达组小鼠脑组织切片，用PBS静置水化及冲洗，加封闭液室温作用1 h，加稀释好的大鼠抗Brdu单克隆抗体4 ℃过夜，次日，PBST洗涤，再加稀释好的驴抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）预吸附二抗孵育，PBST洗涤，依次加4%多聚甲醛常温避光15 min，2N HCl于37 ℃避光30 min，0.1 mol/L硼酸常温避光震荡孵育10 min，PBST洗涤，加稀释好的Anti-Nestin单克隆抗体4 ℃避光过夜，次日，复温后PBST洗涤，加山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647）预吸附二抗37 ℃孵育2 h，PBST冲洗干净，滴加防荧光衰减剂并封片，置于荧光显微镜下观察。

1.2.3.6 RT-qPCR检测脑组织Sox-2mRNA的水平 将对照组、EAE模型组及CBlR过表达组小鼠脊髓组织投入液氮罐中反复冻存使其破碎，用Trizol提取总RNA并进行反转录，以得到的cDNA作为模板进行荧光定量PCR，检测组织中Sox-2的表达水平。同时以β-actin作为内参基因。每个样本均进行3次重复实验。

1.3 统计学方法 GraphPad Prism 5.0软件用于作图，采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用F检验，2组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠神经功能学评分 EAE模型组小鼠在免疫后食欲有所减退，体质量逐渐下降，免疫后10 d开始陆续发病，初期尾部张力减弱或消失，之后步态笨拙，行动不便，随着症状加重最终发生双后肢瘫痪。佐剂组和对照组均未出现任何脑脊髓炎症状，各时间点的平均神经功能评分都是0分，且体质量随着生长不断增加。空载体组小鼠与EAE模型组小鼠在免疫后10 d、14 d、21 d和28 d的平均神经功能评分分别是0.9、1.4、2.3和2.8分，表现相似，神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。CBlR过表达组不同时间点的平均神经功能评分分别是0.9、1.3、1.4和1.6分，与EAE模型组比较，CBlR过表达组随着CBlR表达量的增加，脑脊髓炎症状逐渐减轻，神经功能评分显著下降（P<0.05）。见图1。

2.2 小鼠脑组织中CB1R蛋白表达 Western Blotting检测结果显示，对照组、EAE模型組和CBlR过表达组小鼠脑组织中CBlR/GAPDH分别是0.45、0.18和0.39。EAE模型组明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。CBlR过表达组相较于EAE模型组显著回升，趋近于对照组（P<0.05）。见图2。

2.3 各组小鼠组织病理学变化 HE染色发现，EAE模型组小鼠脊髓腰膨大处组织中出现以淋巴细胞为主的大量炎症细胞浸润，且呈典型的“袖套”状聚集在血管周围;对照组极少见炎症细胞浸润病灶，CBlR过表达组病理变化显著改善，趋向于正常。见图3。

WEIL染色结果显示，EAE模型组小鼠组织中有大小及形状不一的点状或成片的白色空泡，即为髓鞘缺失区域，高倍镜下观察该区域可见存在炎症细胞浸润;对照组小鼠髓鞘整齐而完好，CBlR过表达组亦极少出现髓鞘缺失区域。见图4。

2.4 各组小鼠脑组织室管膜下区Brdu的表达 小鼠脑组织室管膜下区Brdu阳性细胞核呈不规则形、椭圆形或圆形，成簇或散在分布。对照组、EAE模型组和CBlR过表达组Brdu阳性细胞表达率分别是14%、18%和27%。EAE模型组Brdu阳性细胞数增加比对照组显著（P<0.05），CBlR过表达组增加比EAE模型组明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

2.5 各组小鼠脑组织室管膜下区Brdu+/Nestin+的表达 对照组、EAE模型组和CBlR过表达组小鼠脑组织室管膜下区Brdu+/Nestin+阳性细胞表达率分别是2.3%、9.9%和18.2%。EAE模型组小鼠脑组织室管膜下区Brdu+/Nestin+的表达高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;与EAE模型组比较，CBlR过表达组显著升高（P<0.05）。见图6。

2.6 各组小鼠脑组织Sox-2mRNA的水平 对照组、EAE模型组和CBlR过表达组小鼠脑组织中Sox-2/β-actin分别是0.14、0.38和0.61。与对照组比较，EAE模型组小鼠脑组织中Sox-2mRNA水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与EAE模型组比较，CBlR过表达组亦显著增加（P<0.05）。见图7。

3 讨论

大麻素1型受体（CB1R）主要分布于中枢神经系统，脑内的CB1R主要存在于大脑皮质、小脑、海马CA锥体细胞层以及基底神经节的苍白球、黑质和外侧纹状体。其功能为参与运动与体位控制、认知、情感、记忆、内分泌调节等[9-10]。大麻素受体（CBR）被证实在多种神经系统疾病中发挥免疫调节及神经保护的作用。有研究发现，CBlR在正常小鼠脑内的神经元中表达较多，少量表达于小胶质细胞中，星形胶质细胞不表达。此外，在MS患者的皮质神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、浸润的T淋巴细胞及巨噬细胞均有CB1R的表达[11-13]。

本研究结果发现，对照组和佐剂组均未发病，EAE模型小鼠出现脑脊髓炎症状，神经功能评分显著升高，空载体组与EAE模型组症状相似，CBlR过表达组小鼠脑脊髓炎症状逐渐减轻，神经功能评分显著下降。该结果表明EAE模型小鼠成功建立，CBlR可减轻EAE的临床症状。EAE模型组小鼠脑组织中CBlR蛋白表达量显著低于对照组，CBlR过表达组显著升高，提示EAE能降低CBlR蛋白水平，EAE模型小鼠成功实现CBlR过表达。目前已发现多发性硬化（MS）的主要病理变化为炎症细胞浸润、髓鞘脱失以及轴索损伤等。本研究经HE染色发现EAE模型小鼠脊髓腰膨大处组织中大量炎症细胞浸润且呈典型的“袖套”状聚集在血管周围，CBlR过表达组病理变化改善显著，趋向于对照组。WEIL染色发现EAE模型小鼠髓鞘缺失且高倍镜下可见炎症细胞浸润，CBlR过表达组极少出现髓鞘缺失区域，大多髓鞘完好而整齐。该结果进一步证实构建的EAE模型小鼠出现典型的病理改变，CBlR则可逆转EAE对小鼠组织的病理损伤。

作为一种胸腺嘧啶脱核尿苷类似物，Brdu在细胞周期的S期可嵌入到细胞核DNA，常被用作具有增殖活性细胞的标志物，因此新生成的神经干细胞（NSCs）可采用其阳性细胞来表示[14]。DNA进行半保留复制且在S期合成，此时将DNA合成所需要的原料进行标记或者加入原料的类似物，均可进入DNA双链进而标记出新增殖的细胞[15]。以往观点认为人和其他哺乳动物的中枢神经系统被损伤后很难恢复，而近年来随着干细胞的发现，NSCs已相继从啮齿类动物、人的胎盘及成年脑组织中被分离纯化出来[16]。此外，成体哺乳动物中枢神经系统侧脑室壁的室管膜下区（SVZ）及海马齿状回的颗粒下层（SGZ）被证实为NSCs的2个聚集区[17]。神经上皮前体细胞中的一种中间丝蛋白巢蛋白（Nestin），在整个成年期中枢神经系统的神经发生区域均表达的转录因子Sox-2均常被用做NSCs的标志物[18-19]。本研究通过免疫组织化学检测小鼠脑组织室管膜下区Brdu及Brdu+/Nestin+阳性细胞发现，EAE模型组比对照组显著增加，CBlR过表达组比较EAE模型组亦显著增加。RT-qPCR检测小鼠脑组织Sox-2mRNA表达水平与Brdu一致。分析原因可能跟其作用机制有关，正常生理条件下，NSCs不发生增殖分化而是处于相对静息状态，脑组织发生病理损伤可导致微环境的变化，若该刺激达到NSCs分裂增殖的阈值时，NSCs则自我复制产生新细胞，并进行规律性迁移到达特定部位，根据需要分化为相应区域的细胞，进而替代损伤细胞并重建神经功能发挥作用[20]。炎症介质透过血脑屏障进入EAE小鼠的中枢神经系统，微环境的变化使NSCs被激活，因而EAE小鼠中枢神经系统NSCs开始增殖;CBlR过表达组NSCs增殖水平显著高于EAE模型组，提示CBlR可能是通过加速小鼠中枢神经系统中NSCs的增殖进而促进脑组织损伤的修复。

綜上所述，过表达CBlR可加速小鼠中枢神经系统中神经干细胞的增殖，从而促进脑组织损伤的修复，最终实现有效减轻自身免疫性脑脊髓炎小鼠的症状。

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（2020-04-25收稿 責任编辑：杨觉雄）