诊断超声辐照对子代大鼠生长发育及脑组织超微结构的影响

刘艳+周琳瑛+林曦

【摘要】 目的：探讨孕期大鼠超声辐照后对子代生长发育及大脑组织超微结构的影响，从而进一步了解孕期超声检查的安全性。方法：以诊断剂量的超声辐照对孕8 d SD大鼠分别在孕8 d（早期）、孕12 d（中期）及孕16 d（晚期）进行3次时长分别为0 min（无超声辐照，正常对照组）、5、10及20 min的超声辐照后观察子代大鼠生长发育及其大脑组织超微结构的变化。结果：超声辐照20 min组子代大鼠P1、P3、P5、P7体重明显低于对照组（0 min组），差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），首次睁眼时间亦明显推迟，差异有统计学意义（P<0.01），前臂悬挂时间也短，差异有统计学意义（P<0.05）。超声辐照5 min组和10 min组与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：孕期大鼠在孕早中晚期分别进行一次超声辐照，每次超聲辐照时长20 min，可影响子代大鼠生长发育并引起其大脑组织超微结构发生病变。

【关键词】 超声辐照； 子代大鼠； 生长发育； 脑组织； 电镜技术

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.35.030 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）35-0061-03

随着诊断超声技术的不断发展，其在产科应用越来越广泛，目前已成为发现胚胎异常及胎儿畸形首选的检查手段。近年来，为了提高诊断准确率，超声仪器在装备技术和软件开发上日新月异，诊断超声的频率、输出功率均有大幅提高，检查时间也相应增加，其潜在危险就随之增加。因胎儿组织细胞较成人更易受超声生物效应作用，诊断超声的生物效应对胎儿各系统的安全性问题越来越受到国内外学者的关注[1-2]。本实验目的是观察孕鼠早中晚期分别接受不同时长的超声辐照后对子代大鼠生长发育和其大脑组织超微结构的影响，为临床医师在产科超声检查中更好地选择辐照时间提供资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选健康的孕8 d的SD孕鼠（350±21.3）g 16只。

1.2 实验仪器

GE Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪，采用腹部探头频率为3～5 MHz。

1.3 方法

1.3.1 大鼠分组 孕8 d的SD孕鼠（350±21.3）g 16只随机分为四组，每组4只：对照组即无诊断超声辐照组（0 min组）；超声5 min 3次组，即应用诊断超声剂量对孕鼠腹部照射5 min，每隔4 d一次，连续3次（5 min组）；超声10 min 3次组，即应用诊断超声剂量对孕鼠腹部照射10 min，每隔4 d一次，连续3次（10 min组）；超声20 min 3次组，即应用诊断超声剂量对孕鼠腹部照射20 min，每隔4 d一次，连续3次（20 min组）。

而后，各组大鼠正常生产的子代依据生殖器与肛门之间的距离判断雌雄，近者为雌，远者为雄。随机取4只（雌雄各半），取脑组织进行电镜观察以对比各组孕鼠子代脑组织的超微病理变化。

剩余的各组孕鼠生产的子代大鼠随机抽取20只（雌雄各半）进行生长发育的观察，内容包括出生7 d内的体重变化、首次睁眼时间、双上臂悬挂持续的时间。

1.3.2 体重测量 分别于出生即刻P1，出生后第3天P3，出生后第5天P5，出生后第7天P7时间段称量子代大鼠体重，以克（g）为单位。

1.3.3 子代大鼠双眼睁开时间记录 记录子代大鼠双侧眼睛初次睁开的日龄，以天（d）为单位。

1.3.4 子代大鼠上臂悬挂实验 出生后2周P14子代大鼠双前脚抓住一水平金属棍（直径大约0.5 cm），距离桌面30 cm高度，记录子代大鼠双前脚抓牢金属棍后身体悬挂持续的时间，并以分钟（min）为单位计数。

1.3.5 子代大鼠脑组织超微结构观察 大鼠乙醚吸入麻醉后固定，开颅取大鼠脑皮质约（0.1×0.1×0.1）cm3大小的组织4小块，经3%戊二醛-1.5%多聚甲醛（PH=7.4）前固定，4 ℃过夜，磷酸缓冲液（pH=7.4）漂洗3次后1%锇酸-亚铁氰化钾溶液后固定2 h（4 ℃），标本经50%、70%、90%、100%乙醇，100%丙酮逐级脱水，环氧树脂Epon618浸透包埋，超薄切片经硝酸铅-醋酸铀双染后FEI Tecnai BioIWIN透射电镜观察。

1.4 统计学处理

应用统计软件SPSS 14.0统计包对数据进行分析，结果以（x±s）表示，采用one-way ANOVA（完全随机设计的单因素方差分析）进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕鼠接受不同时长超声辐照对子代大鼠生长发育的影响

2.1.1 不同时长超声辐照对子代大鼠出生后1周内体重的影响 0 min组、5 min组、10 min组、20 min组子代大鼠不同日龄体重的变化见图1。超声辐照5 min组和0 min组比较差异无统计学意义（P>0.05），超声辐照10 min组子代大鼠虽然P1、P3、P5、P7体重均低于0 min组，但是差异无统计学意义（P>0.05），而超声辐照20 min组P1、P3、P5、P7各日龄体重明显低于0 min组，各日龄段，两组的比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

2.1.2 不同时长超声辐照后子代大鼠首次睁眼时间比较 各组子代大鼠首次睁眼时间比较见表2。超声辐照5 min组、10 min组子代大鼠睁眼时间与0 min组比较差异无统计学意义（P>0.05），而超声辐照20 min组与0 min组比较，首次睁眼时间明显推迟，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。

各组子代大鼠上臂悬挂时间比较见表1。5 min组和10 min组子代大鼠上臂悬挂时间与0 min组比较差异无统计学意义（P>0.05），而20 min组与0 min组比较，上臂悬挂时间短，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。endprint

2.2 不同时长超声辐照对子代大鼠脑组织超微结构的影响

对0 min组、5 min组、10 min组子代大鼠的脑组织进行电镜观察，神经细胞结构完整，细胞核及细胞质内线粒体、粗面内质网、高尔基复合体等细胞器未见异常，神经细胞突起无水肿等变化（图2）。20 min组子代大鼠脑组织电镜观察可见部分神经细胞内线粒体肿胀，线粒体嵴稀疏断裂（图3），部分神经细胞内粗面内质网轻度扩张，核周隙亦肿胀（图3）。

3 讨论

超声生物效应是指一定强度的超声波（由辐照声强和辐照时间两个因素决定）在生物体系内传播时，通过它们之间一定的相互作用机制（热生物效应、机械生物效应）致使生物体系的功能和结构发生变化[3]。

近年来，许多动物实验表明高功率或者长时间超声辐照会引起绒毛细胞肿胀甚至凋亡，子代體重减轻，胎儿角膜上皮肿胀，子代的生殖细胞线粒体肿胀等变化[4]。Ang等[5]研究发现孕期超声辐照30 min或以上的子鼠大脑皮质细胞有一部分未能移行到大脑皮质相应位置，这种异常分布的皮质细胞数量与超声辐照时间成正相关；王勇等[6]研究发现孕期超声20 min重复辐照可能对子鼠出生后的行为发育产生影响；栗建辉等[7]的研究则发现实时三维超声辐照孕晚期大鼠发现10 min后即可见部分细胞凋亡。

二维彩色多普勒超声的输出功率虽然比实时三维超声低，但孕期常需多次超声检查，因而辐照的次数也比较多。本实验模拟临床孕妇的超声检查，在大鼠孕早期、中期、晚期分别予以诊断剂量超声辐照，观察不同辐照时长对子代大鼠的影响，发现超声辐照5 min及10 min组，子代大鼠出生时体重、首次睁眼时间及前臂悬挂能力与正常对照组相（0 min组）比较差异无统计学意义（P>0.05），脑组织电镜检查也未发现异常，这与目前文献[8-9]的研究结果一致。超声辐照20 min组子代大鼠出生1周内体重均比对照组轻，睁眼时间推迟，出生后2周，前臂悬吊能力弱于正常组，两组相比较差异有统计学意义（P<0.05）。脑组织电镜检查发现部分神经细胞线粒体肿胀，粗面内质网亦可见扩张，核周隙肿胀。这些实验结果与文献[10]研究结果类似。引起这些异常的原因还不确切，可能与直接的超声辐照所产生的生物学效应有关，也可能是超声辐照后引起胎盘绒毛细胞损伤而引起胚胎营养供应不良有关。线粒体是细胞产生ATP的场所，粗面内质网是细胞合成蛋白质的重要细胞器[11]，二者的损伤容易导致神经细胞功能受到影响。有报道探头频率为7.5 MHz的经阴道超声持续照射孕囊10 min可致绒毛细胞损伤，但是这些损伤是可逆的，超声辐照后24 h损伤最明显，而7 d后，绒毛细胞逐渐恢复正常[12]。所以本实验观察到的这些损伤是否可逆，则有待于对子代大鼠进行更进一步的中长期观察。

综上所述，孕鼠早、中、晚孕期接受诊断剂量超声辐照5 min及10 min对子代大鼠生长发育及大脑组织结构无明显影响，而20 min后子代大鼠生长发育及神经细胞超微结构均有受损。ALUM提出了ALARA原则，即产科检查时，在保证能获得必要的超声诊断信息的前提下，用尽可能小的超声输出功率，在尽可能短的时间（建议<20 min）内完成检查[13]。

参考文献

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（收稿日期：2017-08-03）endprint