大蒜有效部位组合物对模型大鼠胃癌前病变的疗效和作用机制

那坤 张立石 王瑞海 柏冬 苗青 孙小鑫 刘丽梅

摘要 目的：研究大蒜油-大蒜皂苷-大蒜多糖组合物治疗胃癌前病变的疗效，阐明该组合物治疗胃癌前病变的作用机制。方法：将大鼠随机分为空白对照组（n=14）和造模组（n=144）。于造模22周时，将造模组大鼠再随机分为6组：模型组（n=24）、大蒜油对照组（n=24）、胃复春对照组（n=24）、组合物高、中、低剂量组（3×24）。连续给药13周后处死。取材后，在光镜下观察胃黏膜的病理学变化。同时，采用电化学发光法检测各组大鼠离心血浆中的3种肿瘤标志物CEA、CA199、CA724的水平。运用Western Blotting和Real-time PCR技术检测胃癌前病变大鼠胃组织中TGF-β1和Smad4的蛋白和mRNA表达情况。结果：1）组合物高剂量（2.38 g/kg）组能够显著地改善胃癌前病变大鼠胃黏膜的病理变化。2）组合物高剂量（2.38 g/kg）组能够明显降低胃癌前病变大鼠血清中的CEA、CA199、CA724 3种肿瘤标志物的水平。3）组合物高剂量（2.38 g/kg）组能够下调TGF-β1 mRNA及其蛋白表达水平，而能够上调Smad4 mRNA及其蛋白表达水平。结论：组合物高剂量（2.38 g/kg）组能够显著改善胃癌前病變大鼠胃黏膜的病理变化，降低血清肿瘤标志物水平，调节TGF-β1和Smad4的蛋白表达，从而纠正TGF-β/Smads信号转导通路的异常变化，有效地治疗胃癌前病变。

关键词 大蒜油;大蒜皂苷;大蒜多糖;组合物;甲基硝基亚硝基胍;大鼠;胃癌前病变;机制探讨

Abstract Objective：To study the efficacy of garlic YZD composition in the treatment of gastric precancerous lesions，and to further clarify the mechanism of garlic YZD composition in the treatment of gastric precancerous lesions.Methods：The rats were randomly divided into 2 groups：a control group（14 rats） and a model group（144 rats）.After 22 weeks of modeling，the rats were randomly divided into 6 groups：a model group，a garlic oil control group，a Weifuchun control group，a garlic YZD composition high，a medium and low dose groups，with 24 rats in each group.They were killed after 13 weeks of continuous administration.After taking the material，the pathological changes of gastric mucosa were observed under light microscope.At the same time，the levels of three tumor markers CEA，CA199 and CA724 in the centrifuged plasma of rats in each group were detected by electrochemiluminescence.Western Blotting and Real-time PCR were used to detect the protein and mRNA expression of TGF-β1 and Smad4 in gastric tissues of rats with gastric precancerous lesions.Results：1）High dose group of garlic YZD composition（2.38 g/kg） could significantly improve the pathological changes of gastric mucosa in rats with gastric precancerous lesions.2）High dose group of garlic YZD composition（2.38g/kg） can significantly reduce the levels of CEA，CA199 and CA724 tumor markers in serum of rats with gastric precancerous lesions.3）High dose group of garlic YZD composition（2.38g/kg） can down regulate the expression level of TGF-β l mRNA and its protein，but up regulate the expression level of Smad4 mRNA and its protein.Conclusion：High dose group of garlic YZD composition（2.38 g/kg） can significantly improve the pathological changes of gastric mucosa in rats with gastric precancerous lesions，reduce the level of serum tumor markers，regulate the protein expression of TGF-β1 and Smad4，so as to correct the abnormal changes of TGF-β1/Smads signal transduction pathway，and effectively treat the precancerous lesions of gastric cancer.

Keywords Garlic oil;Garlic saponin;Garlic polysaccharide;Composition;MNNG;Rats;Precancerous lesion of gastric cancer;Mechanism discussion

中图分类号：R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.015

胃癌前病变属中医学中的“胃脘痛”“痞满”范畴。中医专家对于胃癌前病变的中医病因和病机目前尚无一致认识。正气可视为机体的免疫功能，邪气为各种有害因素，可破坏人体内部或人体与外界环境间的相对平衡状态[1]。疾病的发生和发展过程大都是正气与邪气互相斗争的结果，进而导致机体内部功能失调或内部与外部环境之间相互关系紊乱，器官、组织、细胞、蛋白质、基因的功能、代谢或形态结构产生较大改变[2]。正气旺盛则机体免疫功能正常，正气虚弱导致机体正常的免疫功能遭到破坏或抑制，进而不能有效识别和杀伤体内出现的少量异常细胞，即癌细胞，从而形成肿瘤。若邪气胜过正气，則可导致肿瘤的进一步发展[3]。由此可见治疗胃癌前病变的中医基本治疗方法为扶正祛邪之法，本实验采用的药物大蒜油-大蒜皂苷-大蒜多糖组合物（大蒜YZD）由大蒜提取纯化得到的3个有效部位组成：大蒜油（大蒜油含有的二烯丙基二硫和二烯丙基三硫在组合物中含量为1.51%）、大蒜皂苷（在组合物中含量为8.49%）和大蒜多糖（在组合物中含量为38.86%）。经筛选确定组方（专利号：ZL201110053280.9）治疗胃癌前病变，本实验考察大蒜YZD治疗胃癌前病变的治疗效果，并探讨大蒜YZD治疗胃癌前病变的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用4周龄Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，158只，体质量55～70 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-（军）2007-004，在中国中医科学院基础理论研究所清洁级动物室喂养，实验动物室许可证号：SYXK（京）-2010-0032，动物福利伦理委员会批准通过（伦理审批号：2010-046）。

1.1.2 药物 大蒜YZD药液、大蒜油、胃复春片、0.03%雷尼替丁、甲基硝基亚硝基胍（MNNG）溶液。

1.1.3 试剂与仪器 N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）（日本东京化成工业株式会社，CAS号：70-25-7，EINECS号：200-730-1）;胃复春片（杭州胡庆余堂药业有限公司，国药准字Z20040003）;大蒜油和大蒜YZD（中国中医科学院中医基础理论研究所中医方证基础研究中心质量分析室大蒜课题组提供）;E170免疫分析仪（罗氏公司，瑞士，型号：2009-18）;K15离心机（Sigma公司，德国，型号：3K15）;LeicaDM6000生物显微镜（Leica公司，德国，型号：M）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）分组：随机分为空白对照组（n=14）和模型组（n=144）。于造模22周，将造模组大鼠再随机分为6组：模型组、大蒜油对照组、胃复春对照组、大蒜YZD高、中、低剂量组，每组24只。2）造模方法：多因素联合法：自由饮用100 μg/mL甲基硝基亚硝基胍（MNNG）溶液，MNNG溶液为每周用纯净水配制成1 g/L浓度的母液于4 ℃避光保存，临时用纯净水配成所需浓度;0.03%雷尼替丁饲料喂食。3）造模检测：自然死亡大鼠随时检测;造模周期结束随机从各组抽取1只处死并检测。

1.2.2 给药方法 造模35周后开始治疗，大蒜YZD高、中、低剂量组分别灌胃给予浓度为0.238 g/mL、0.119 g/mL、0.059 5 g/mL的大蒜YZD药液，给药容积为1 mL/100 g体质量，给药剂量为2.38 g/kg、1.19 g/kg、0.595 g/kg体质量;胃复春组和大蒜油组分别灌胃给予浓度为0.1 g/mL的胃复春混悬液和浓度为6.3 mg/mL的大蒜油乳浊液，给药容积均为1 mL/100 g体质量，给药剂量分别为1.0 g/kg体质量和63 mg/kg体质量。以上给药1次/d，连续6 d，停止给药1 d后，再连续给药6 d，如此给药13周。空白对照组和模型组则按上法给予等容积的纯净水。

1.2.3 检测指标与方法 给药13周后，将各组大鼠用戊巴比妥钠注射液进行麻醉，麻醉后腹主动脉取血5 mL，血液离心20 min，2 500 r/min，离心半径8 cm，离心完毕后取血清，分装后放置-80 ℃冰箱储存。将大鼠开腹后立即取出胃进行称重，取胃大弯部分，平均分为两部分，一部分放在甲醛里固定，一部分放在液氮罐里保存。常规取材，胃经固定后，取出约1.0 mm×2.0 mm大小胃组织块，并迅速放置于4%多聚甲酸溶液中固定，经过24 h后进行石蜡包埋，连续切片6张，将切片进行HE染色，光镜下进行胃黏膜的病理学观察。大鼠胃黏膜异形增生、肠腺化生、萎缩按全国胃癌防治研究协作组病理组1978年制定的标准进行诊断。1）轻度不典型增生：鳞状上皮增厚，有一定异形性，基底膜完整，腺体明显增多，腺腔扩大，腺细胞核亦增大，异形性不明显;2）中度不典型增生：鳞状上皮增厚，有一定异形性，基底膜完整，腺体明显增多，腺腔扩大，腺细胞核深染，有一定的异形性，未见核分裂;3）重度不典型增生及早期癌变：同中度，但可见核分裂;4）肠上皮化生：胃黏膜上皮细胞可见肠上皮的杯状细胞[4]。同时，采用电化学发光法检测各组大鼠离心血浆中的3种肿瘤标志物CEA、CA199、CA724的水平。运用Western Blotting和Real-time PCR技术检测胃癌前病变大鼠胃组织中TGF-β1和Smad4的蛋白和mRNA表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，组间多重比较采用Scheffe法，其中计数资料以百分率表示，计量资料以均数±标准差（±s）表示，以P<0.05為差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组实验大鼠的状态 空白对照组大鼠精神状态良好、灵活喜动、神态自如，行为未见异常，二便、饮食正常，毛发光泽，皮肤黏膜呼吸未见异常，五官未见异常分泌物;模型组大鼠少动，精神萎靡，皮肤欠光泽，毛发凌乱;大蒜油组、大蒜YZD中剂量组、大蒜YZD低剂量组大鼠均有一定程度的饮食和活动减少，皮毛无光泽，精神不振;大蒜YZD高剂量组和胃复春组大鼠状态较空白对照组大鼠活动略少，精神状态、精力欠佳，皮毛光泽度减低。

2.2 胃黏膜病理学变化

2.2.1 肉眼观察 肉眼观察可见模型组大鼠胃壁较薄，无黏液，无光泽，弹性较差，黏膜呈灰白色或苍白色，局部黏膜可见细颗粒样改变和散在出血点;空白对照组大鼠胃壁弹性良好，被覆盖黏液较多，黏膜呈粉红色，有光泽，黏膜表面平整光滑;大蒜YZD高、中、低剂量组及大蒜油组和胃复春组大鼠胃壁弹性未见明显异常，黏膜皱襞相对较深，可见少量黏液附着，黏膜呈暗红色或淡红。

2.2.2 HE染色后显微镜观察 1）空白对照组：胃黏膜上皮完整，细胞的形态均匀一致，固有膜内腺体排列整齐紧密，可见少量的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞，胃窦及胃体部未见明显的炎症细胞浸润。未见有充血、水肿，黏膜肌层较薄。2）模型组：胃局部黏膜不完整部分腺体萎缩或消失，可见有不同程度的腺体结构紊乱，或呈囊状扩张。表面可见脱落的变性、坏死的上皮细胞，上皮细胞核比例增大、浓染，有不同程度的异形性，有的见核分裂象。黏膜固有层内可见较多淋巴细胞、浆细胞，少数嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞浸润。而且浸润可深达黏膜肌层，黏膜肌层厚薄不匀，有的向固有膜延伸，在腺体之间可见平滑肌纤维，部分黏膜可见淋巴细胞聚集及淋巴滤泡形成，血管增生，可见有肿瘤形成。3）大蒜YZD低剂量组：胃体黏膜腺体排列相对较整齐，细胞形态未见异常，腺管和腺体上皮分界清楚，少部分腺体可见萎缩、肠化，炎症细胞浸润主要局限于黏膜浅层，固有腺体层仍保持完整。4）大蒜油组和大蒜YZD中剂量组：胃窦黏膜和胃体黏膜炎症程度轻于模型组、大蒜YZD低剂量组，镜下可见胃黏膜水肿、充血和上皮坏死细胞脱落，少量浆细胞、淋巴细胞浸润，部分组织可见少量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润。5）大蒜YZD高剂量组：大鼠胃黏膜上皮比模型组胃黏膜上皮完整，细胞形态较为较均，原有膜内腺体排列较为整齐，可见较少量的淋巴细胞，腺上皮与腺管边界清晰，炎症细胞浸润多分布在黏膜浅表层。6）胃复春组：胃窦和胃体部黏膜炎症反应轻于模型组，显微镜下可以看到黏膜水肿、充血以及上皮坏死细胞脱落，淋巴细胞和浆细胞浸润，偶见胃黏膜糜烂，散见中性粒细胞、嗜酸性粒细胞，镜下能够见到核深染以及肠化生。7）模型组大鼠胃黏膜病理损伤程度明显高于空白对照组（P<0.01），大蒜YZD高剂量组和胃复春组与模型组比较（P<0.01）大鼠胃黏膜病理损伤程度明显降低;大蒜油组、大蒜YZD中剂量组，大蒜YZD低剂量组大鼠胃黏膜病理损伤程度与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）;大蒜YZD高剂量组与大蒜油组、大蒜YZD中剂量组、大蒜YZD低剂量组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1，图2。

2.3 各组肿瘤标志物结果比较 治疗后各组CEA、CA199、CA724肿瘤标志物与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）;大蒜YZD高剂量组和胃复春组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）;其余各给药组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）;大蒜YZD高剂量组与大蒜YZD中、低剂量组和大蒜油组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 各组TGF-β1和Smad4 mRNA表达情况比较

2.4.1 TGF-β1mRNA的表达情况 模型组中TGF-β1 mRNA高表达，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），大蒜YZD高剂量组和胃复春组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），其他给药组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），大蒜YZD高剂量组中TGF-β1 mRNA表达水平低于大蒜YZD中、低剂量组和大蒜油组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2～6。

2.4.2 Smad4 mRNA的表达情况 模型组中Smad4 mRNA的表达水平较低，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），大蒜YZD高剂量组和胃复春组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），其他各给药组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），大蒜YZD高剂量组中Smad4 mRNA的表达水平较高，与大蒜YZD中、低剂量组和大蒜油组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图7～11。

2.5 各组TGF-β1和Smad4蛋白表达结果比较

2.5.1 TGF-β1蛋白表达结果 模型组的条带表达最强，与β-actin接近;而空白对照组条带表达最弱，其余各组条带表达强弱介于空白对照组和模型组之间。模型组和各给药组与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），大蒜YZD高剂量组和胃复春组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），其他给药组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），大蒜YZD高剂量组TGF-β1蛋白表达强度低于大蒜YZD中、低剂量组和大蒜油组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图12。

2.5.2 Smad4蛋白表达结果 空白对照组条带表达最强，模型组条带表达最弱，其余各组条带表达强弱介于空白对照组和模型组之间。模型组和各给药组与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），大蒜YZD高剂量组和胃复春组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），其他各给药组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），大蒜YZD高剂量组Smad4蛋白表达强于大蒜YZD中、低剂量组和大蒜油组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图13。

3 讨论

大蒜在我国较早地使用在细菌和真菌感染以及病毒感染的治疗中。近几年来国内外的流行病学调查和实验研究均证明，长时间食用一定量大蒜，胃癌发病率與死亡率都显著下降[5]。大蒜能够降低肿瘤发生率，具有抗肿瘤的药理作用，作用机制可能和大蒜中含硫化合物影响细胞信号的转导，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长有关[6]。大蒜为天然的抗肿瘤药物，对人体的不良反应较小，可与其他抗肿瘤药物联合应用，增强抗肿瘤的作用，减少抗肿瘤药物的耐药性[7-9]。因此，本实验选取大蒜提取纯化的3个有效部位，按照前期正交实验筛选的组方配比，将3个有效部位按照1∶10∶20的比例混合配制成大蒜YZD组合物溶液[10]，并将大蒜YZD组合物溶液分为高、中、低3种剂量给实验大鼠灌胃，观察疗效。

经过13周药物治疗后，观察到大蒜YZD高剂量组与模型组比较大鼠胃黏膜病理损伤程度明显降低;大蒜油组、大蒜YZD中剂量组，大蒜YZD低剂量组大鼠胃黏膜病理损伤程度与模型组比较差异无统计学意义;大蒜YZD高剂量组与大蒜油组、大蒜YZD中剂量组、大蒜YZD低剂量组比较差异有统计学意义。表明大蒜YZD高剂量组能够有效的降低胃黏膜损伤程度，可能对损伤的胃黏膜有较好的修复作用。

CEA是大肠癌组织产生的一种糖蛋白，也是一种酸性蛋白，作为抗原可引起患者的免疫反应，此种抗原称为癌胚抗原，癌旁正常黏膜CEA含量很少或为阴性。CEA作为肿瘤标志物已经广泛应用在胃肠道及其他上皮源性肿瘤的研究[11]。97%正常成人血清CEA浓度在2.5 ng/mL以下。根据文献研究报道原发性结肠癌患者CEA增高占45%～80%，胆管癌、肺癌、食管癌、胰腺癌阳性率在50%～70%，胃癌CEA的敏感度为33.3%～70.4%，特异度为80%～90%[12]。CA199属于低聚糖肿瘤相关蛋白，为细胞膜上的糖脂质，分子量大于1 000 kD，在血清中它以唾液黏蛋白形式存在，其与CEA均是胃癌的重要标志物，多用于病情的监测及预后判断[13]。有研究表明，血清CA199诊断胃癌的敏感度为26.3%～69.0%，特异度为52.0%～95.0%[14]。CA724是一种由cc49和B72.3两株单抗识别的黏蛋白样的大分子量糖蛋白，分子量为220～400 kD，正常人血清中含量<6 U/mL，对于胃癌检测的特异度和敏感度较高，以>6 U/mL为临界值，在临床中与CEA、CA199同时检测能够大幅提高胃癌的诊断率[15]。CA724临床诊断胃癌的敏感度为55%～90%，特异度为80%～95%[16]。

大蒜YZD高剂量组和胃复春组在给予13周的药物治疗后，血清中CEA、CA199、CA724 3种肿瘤标志物与模型组比较明显降低，而且大蒜YZD高剂量组和胃复春组疗效明显优于其他给药组。大蒜YZD高剂量组与大蒜YZD中、低剂量组、大蒜油组比较疗效显著，大蒜YZD中剂量组与大蒜YZD低剂量组和大蒜油组比较差异无统计学意义。大蒜YZD高剂量组能够有效降低胃癌前病变大鼠血清中的CEA、CA199、CA724 3种肿瘤标志物水平，且疗效优于大蒜YZD中、低剂量组。由此可见，大蒜YZD高剂量能够抑制肿瘤黏蛋白和糖蛋白的合成，具有一定的抗肿瘤生长作用。

TGF-β1作为一种多功能的细胞因子，能够主导细胞产生与分化，细胞的移动和黏附，同时在肿瘤的各个阶段发展过程中具有主要作用[17]。TGF-β1能够促进细胞增殖，细胞外基质产生，同时TGF-β1具有负反馈调节功能，TGF-β1能够诱导原癌蛋白SnoN的表达，大量实验结果表明SnoN是TGF-β1应答基因，在TGF-β信号的负反馈调节中起着重要作用[18]。TGF-β1的高表达会直接诱导原癌基因SnoN的表达显著增高，这可能是细胞恶性转化的一个重要机制[19]。Smad4又称DPC4，为抑癌基因，是从胰腺癌细胞中筛选出来的，它对正常及癌细胞具有生长抑制作用[20]。Smad4为TGF-β1信号转导的细胞内信使，将TGF-β1信号从细胞膜转至细胞核，其表达异常，可使TGF-β1信号传递中断，导致细胞不受TGF-β1信号的抑制[21]。R-Smads磷酸化后能与Smad 4形成异聚体，转移入核内调节基因的转录，活化的Smad4异聚体能活化对TGF-β1反应的荧光素酶基因的转录[22]。TGF-β/Smads信号转导通路是一个比较复杂的过程，通路中的任何一个环节发生改变，都会导致信号转导通路出现异常，进而使正常细胞生长、分化失去控制，导致正常细胞向癌细胞转变，同时促使正常细胞大量异常增殖，进而致使癌症出现[23]。

本研究发现TGF-β1和Smad4的蛋白表达水平与mRNA的表达水平基本上是一致的。大蒜YZD高剂量组和胃复春组下调TGF-β1蛋白和mRNA表达水平明显优于其他各给药组。大蒜YZD高剂量组与大蒜YZD中、低剂量组、大蒜油组比较差异有统计学意义，大蒜YZD中剂量组与大蒜YZD低剂量组、大蒜油组比较三者差异无统计学意义。

大蒜YZD高剂量组与胃复春组上调Smad4的蛋白和mRNA表达水平明显优于其他各给药组。大蒜YZD高剂量组与大蒜YZD中剂量组、大蒜YZD低剂量组、大蒜油组比较差异性显著，大蒜YZD中剂量组与大蒜YZD低剂量组、大蒜油组比较三者差异无统计学意义。

本研究结果表明：大蒜YZD高剂量组通过靶向性下调TGF-β1的蛋白表达，上调Smad4的蛋白表达，改善Smad4的突变状态，发挥其调控转运作用，与活化后的受体调节型Smads蛋白相结合，产生一种低聚体的复合物，在TGF-β/Smads信号转导过程中起到主要作用，可抑制原癌基因表达，减少肿瘤细胞的形成，从而改善胃黏膜病理变化，阻止胃癌前病变的发生和发展。大蒜YZD高剂量组通过调节TGF-β1和Smad4的蛋白表达，从而纠正TGF-β/Smads信号转导通路的异常变化，这可能是大蒜YZD高剂量组治疗胃癌前病变的主要作用机制之一。本研究为大蒜3个有效部位组方，集合大蒜的水溶性和脂溶性成分于一体，各有效部位抗肿瘤机制作用不同，相互配伍可以提高人体免疫调节功能，能够体现大蒜有效部位多靶点、多环节、整体调节的综合治疗特点，故大蒜YZD可能会成为治疗胃癌前病变新的治疗药物。

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（2020-08-25收稿 责任编辑：吴珊）