白芍总苷对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的影响及机制

赵阳 刘素芳 苏亚双 李俊芳 马向波 娄重章 孙琦

摘要 目的：探究白芍总苷（TGP）对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响及其作用机制。方法：将人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）分为对照组、模型组和干预组，其中对照组细胞常规培养;模型组和干预组细胞使用肿瘤坏死因子（TNF）-α10 ng/mL培养建立RA体外细胞模型;随后干预组细胞使用TGP 62.5 μg/mL培养，对照组和模型组细胞使用等量生理盐水培养;采用CCK-8法检测细胞增殖能力;原位末端轉移酶标记技术（TUNEL）检测细胞的凋亡率;酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测白细胞介素（IL）-6和血管内皮生长因子（VEGF）水平;Western Blotting检测磷酸化JAK2蛋白（p-JAK2）、磷酸化STAT1蛋白（p-STAT1）以及磷酸化STAT3蛋白（p-STAT3）的表达水平。结果：CCK-8和TUNEL结果显示TGP可抑制HFLS-RA细胞增殖，促进细胞凋亡;ELISA结果显示TGP可降低细胞中IL-6和VEGF的水平;Western Blotting实验显示TGP可降低p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的表达水平（P<0.05）。结论：TGP可通过调节JAK/STAT信号通路抑制HFLS-RA细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制滑膜细胞炎症反应和血管生成。

关键词 白芍总苷;类风湿关节炎;成纤维样滑膜细胞;增殖;凋亡;白细胞介素-6;血管内皮生长因子;JAK/STAT信号通路

Abstract Objective：To investigate the effects of total glucosides of paeony（TGP） on the proliferation，apoptosis and inflammatory response of fibroblast synovial cells in rheumatoid arthritis and its mechanism.Methods：Human fibroblast-like synoviocytes（HFLS-RA） were divided into a control group，a model group and an intervention group randomly，and the cells of the control group were cultured routinely.Cells in the model group and intervention group were cultured with tumor necrosis factor（TNF）-α 10 ng/mL to establish RA cell models in vitro.Subsequently，cells in the intervention group were cultured with TGP 62.5 μg/mL，and cells in the control group and model group were cultured with the same amount of normal saline.CCK-8 assay method was used to detect cell proliferation.Cell apoptosis rate was detected by in situ end transferase labeling（TUNEL）.The levels of interleukin（IL）-6 and vascular endothelial growth factor（VEGF） were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression levels of phosphorylated JAK2（p-JAK2），phosphorylated STAT1（p-STAT1） and phosphorylated STAT3（p-STAT3） were detected by Western blotting.Results：CCK-8 and TUNEL assay showed that TGP could inhibit the proliferation of HFLS-RA cells and promote cell apoptosis.ELISA assay showed that TGP can reduce the levels of IL-6 and VEGF in cells.Western blotting assay showed that TGP can reduce the expression levels of p-JAK2，p-STAT1 and p-STAT3（P<0.05）.Conclusion：TGP can inhibit HFLS-RA cell proliferation，promote cell apoptosis，inhibit synovial cell inflammation and angiogenesis by regulating JAK/STAT signaling pathway.

Keywords Total glucosides of paeony; Rheumatoid arthritis; Fibroblastoid synovial cells; Proliferation; Apoptosis; Interleukin-6; Vascular endothelial growth factor; JAK/STAT signaling pathway

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.013

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，可引起不可逆的关节损伤和严重残疾，患病率约为1%[1-2]。RA发病的主要特征为滑膜组织增生和关节结构破坏，是由于人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）的增殖和凋亡平衡失调，导致HFLS-RA不断“肿瘤样”增生[3-4]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是众多炎症介质中的关键因子，可产生有丝分裂原作用，促进RA滑膜成纤维细胞的增殖，目前常被用來诱导HFLS-RA损伤构建RA体外细胞模型[5-6]。白芍总苷（Total Glucosides of Paeony，TGP）是从中药白芍根部提取的主要有效成分，具有益气止痹，养血柔肝等功效，现代药理学研究表明，TGP具有抗炎、镇痛、抗应激等作用，并可参与某些细胞信号转导通路的调节，对RA等自身免疫性疾病确有疗效[7-8]。然而，TGP在RA中的潜在机制尚不清楚。本研究通过构建RA体外细胞模型，旨在探讨TGP对HFLS-RA增殖、凋亡以及炎症反应的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA），购自北京北纳创联生物技术研究院。细胞置于添加了10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。

1.1.2 药物 TGP胶囊，规格：0.3 g/粒（宁波立华制药有限公司，批号：20191203）。使用TGP胶囊时去外胶囊壳，将内粉末溶于生理盐水配置成TGP溶液62.5 μg/mL。

1.1.3 试剂与仪器 胎牛血清（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0227）;青霉素-链霉素溶液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0222）;化学发光（ECL）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0018FS）;DMEM培养基（Gibco公司，美国，货号：A4192101）;TNF-α（Sigma公司，美国，货号：H8916-10UG）;CCK-8细胞计数试剂盒（上海炎熙生物科技有限公司，货号：CT-K-1）;原位末端转移酶标记技术（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司，货号：40308ES20）;酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号：ml057925-2）;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳液（北京百奥莱博科技有限公司，货号：YT619）;聚氰基丙烯酰正丁酯（BCA）蛋白定量试剂盒（上海赛默飞世尔科技公司，货号：23250）;一抗磷酸化JAK2（p-JAK2）蛋白抗体（Abcam公司，英国，货号：ab32101）、一抗磷酸化STAT1（p-STAT1）蛋白抗体（Abcam公司，英国，货号：ab109461）;一抗磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白抗体（Abcam公司，英国，货号：ab267373）;GAPDH（Abcam公司，英国，货号：ab8245）;二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（Abcam公司，英国，货号：ab6721）;电泳仪（南京普阳科学仪器研究所，型号：DYY-6C）;快速智能蛋白湿转仪（南京金斯瑞生物科技有限公司，型号：L00686C）;酶标仪（BioTek公司，美国，型号：synergy2）;倒置荧光显微镜（上海点应光学仪器有限公司，型号：DYF-880）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将HFLS-RA随机分为对照组、模型组和干预组。模型组和干预组细胞使用TNF-α10 ng/mL培养制备RA体外细胞模型。每组3个样本。

1.2.2 给药方法 对照组细胞常规培养，不做任何干预处理;干预组细胞使用TGP 62.5 μg/mL培养;模型组细胞使用等量生理盐水培养。24 h后，收集各组细胞用于后续实验。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 CCK-8细胞增殖实验 取HFLS-RA细胞，使用胰酶消化稀释，以每孔1104接种于96孔板中，分别在24 h、48 h、72 h将10 μL CCK-8试剂加入每孔孵育2 h，另外在不含细胞的培养基中加入等量CCK-8试剂，设为空白组，而后在酶标仪450 nm波长处测定各组细胞光密度（OD）值。

1.2.3.2 TUNEL染色细胞凋亡实验 取HFLS-RA，使用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，5%多聚甲醛固定5 min，PBS冲洗细胞3次，每次5 min，再用3% H2O2和0.1% Triton X-100培养10 min，之后使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒染色，最后用DAPI标记1 min，37 ℃避光孵育1 h。细胞核染为绿色为凋亡细胞，荧光显微镜下计数凋亡细胞数和总细胞数，计算每组细胞的凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.3.3 ELISA实验检测白细胞介素（IL）-6和血管内皮生长因子（VEGF）水平 取HFLS-RA培养上清液，使用ELISA试剂盒检测细胞中IL-6和VEGF水平。

1.2.3.4 Western Blotting实验 取HFLS-RA，使用RIPA裂解缓冲液匀浆裂解，高速离心后收集蛋白上清，用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，再将蛋白置于水浴锅中100 ℃下加热10 min变性。进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，随后电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含5%脱脂乳脂的TBST封闭2 h，加入一抗于4 ℃条件下孵育过夜。TBST溶液漂洗PVDF膜后，再加入二抗室温孵育1 h。TBST溶液再次漂洗后使用ECL化学发光显影，采用Image J图像分析系统分析各组蛋白条带灰度值，以GAPDH作为内参，检测各组p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3蛋白的表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。所有数据以均值±标准差（±s）表示，3组比较用单因素方差分析，组间差异有统计学意义时，两两比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGP对HFLS-RA细胞增殖的影响 与对照组比较，模型组光密度值显著上升（P<0.05）;而与模型组比较，干预组细胞光密度值显著降低（P<0.05）。见表1。

2.2 TGP对HFLS-RA细胞凋亡的影响 与对照组比较，模型组的细胞凋亡率显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;而与模型组比较，干预组的细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，图1。

2.3 TGP对HFLS-RA细胞中IL-6和VEGF水平的影响 与对照组比较，模型组中IL-6和VEGF水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;而与模型组比较，干预组中IL-6、VEGF的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 TGP抑制HFLS-RA细胞中p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3蛋白的表达 与对照组比较，模型组中p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;而与模型组比较，干预组中p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4，图2。

3 讨论

HFLS-RA在RA病理过程中发挥重要作用，具有增殖和凋亡异常的特点[9]，因此抑制HFLS-RA的异常增殖，诱导细胞凋亡成为治疗RA的主要策略之一[10-11]。另外，HFLS-RA是滑膜炎症增生的主要效应细胞，在炎症刺激下可分泌大量炎症介质，如IL-6等。VEGF是促进血管形成的重要细胞因子，同时参与RA发病过程[12-13]。TGP主要含有芍药苷，羟基芍药苷、芍药花苷以及芍药内酯苷等成分，研究发现其具有抑制自身免疫反应的作用，可在RA的治疗过程中发挥疗效[14-15]。如贾敏等[16]发现，TGP可减轻关节炎大鼠足趾肿胀度以及炎关节部位的骨质破坏情况;戴杏等[17]学者研究发现芍药苷可降低TNF-α刺激下成纤维滑膜细胞中IL-1β和前列腺素E2的水平，并提高细胞内环磷腺苷水平。本研究通过使用TNF-α刺激细胞构建RA体外细胞模型，而后给予TGP联合培养细胞，发现TGP可显著抑制HFLS-RA增殖以及炎症反应，并促进细胞凋亡，这提示TGP对HFLS-RA具有保护作用。

Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路是一种可介导生长因子和炎症介质的信号途径，包括JAK2，STAT1，STAT3等蛋白[18-20]。研究表明，JAK/STAT信号通路与RA等自身免疫性疾病的发病机制密切相关，涉及自身免疫的许多细胞因子都使用JAK和STAT来转导细胞内信号，且在RA滑膜关节组织中持续激活，导致炎症介质的大量分泌[21]。本研究证实，使用TNF-α刺激HFLS-RA可激活JAK/STAT信号通路，增加JAK2，STAT1，STAT3等蛋白的磷酸化水平[22]。TGP处理HFLS-RA后，p-JAK2，p-STAT1，p-STAT3的表达均得到显著抑制。

综上所述，TGP可显著抑制HFLS-RA的过度增殖和炎症反应，并促进细胞凋亡，提示其作用机制可能是通过调节JAK/STAT信号通路而实现。

参考文献

[1]肖智，胡筱薇，卿照前.外敷透骨血竭散对类风湿性关节炎活动期anti-CCP、DKK-1影响的研究[J].世界中医药，2021，16（3）：482-486.

[2]曹庆勇，王培源，王巧云，等.通痹胶囊对类风湿性关节炎模型兔关节病变的影响[J].中国中药杂志，2018，43（5）：1034-1041.

[3]刘淑清，陈湘君.益气补肾活血方治疗活动性类风湿关节炎临床观察[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（7）：85-87.

[4]陈慧芳，王晓霞，何佳莉，等.肿瘤坏死因子α与白细胞介素6和白细胞介素10及相关信号通路在类风湿关节炎合并抑郁症中的研究进展[J].中国医药，2019，14（4）：629-632.

[5]罗素，荣晓凤，彭菲菲.大黄素对TNF-α诱导的成纤维样滑膜细胞株MH7A细胞ERK1/2和p38MAPK的影响[J].免疫学杂志，2017，33（2）：113-117.

[6]王沁，余叶，陈伟钱，等.肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂在类风湿关节炎中的研究进展[J].中华风湿病学杂志，2019，23（4）：266-269.

[7]杨夏，李焕平.白芍总苷治疗系统性红斑狼疮患者的临床疗效及对免疫功能的影响[J].世界中医药，2019，14（5）：1270-1273.

[8]贾岚，王蕾蕾，孟靓，等.白芍总苷对大鼠化学性肝损伤与肝阴虚证结合模型的影响和机制研究[J].中草药，2020，51（7）：1885-1892.

[9]刘小平，赵旭颖，侯秀娟，等.芍甘附子汤加味通过HIF-VEGF-ANG轴诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的机制[J].中华中医药杂志，2019，34（9）：4013-4016.

[10]刘维，杨会军，吴沅皞，等.中药及其有效成分影响类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和凋亡的研究進展[J].中草药，2016，47（5）：844-850.

[11]刘蔚翔，姜泉.类风湿关节炎“湿、热、瘀”病机理论探析[J].中医杂志，2020，61（24）：2148-2153.

[12]何莲花，李逸群，王靖霞，等.风湿祛痛胶囊对TNF-α诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞功能的影响[J].中国实验方剂学杂志，2019，25（7）：116-121.

[13]毕文慧，刘暘.VEGF在类风湿关节炎发生、发展及治疗中的研究进展[J].内蒙古医科大学学报，2019，41（2）：211-214.

[14]马丽，李作孝.白芍总苷的免疫调节功能及其临床应用[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（17）：244-246.

[15]王巧，刘荣霞，毕开顺，等.HPLC法测定白芍总苷胶囊中芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷[J].中草药，2005，36（11）：1630-1632.

[16]贾敏，张寒，杨颖，等.白芍总苷对关节炎大鼠骨质破坏及T细胞表达RANKL的影响[J].中药藥理与临床，2012，28（6）：62-65.

[17]戴杏，郭晓蓉，魏伟.芍药苷对肿瘤坏死因子-α诱导的人成纤维样滑膜细胞功能的影响[J].中国临床药理学杂志，2009，25（1）：58-62.

[18]张阳，赵柯心，张磊.醉茄素A通过JAK/STAT通路对人肝癌耐药细胞HepG2/ADM凋亡的影响[J].现代药物与临床，2020，35（4）：641-646.

[19]葛改，杨智雅，张祥宇，等.SOCS通过调控JAK/STAT通路影响Th细胞分化在感染性疾病中的作用研究进展[J].中国真菌学杂志，2021，16（1）：51-55.

[20]包洁，张喜召，窦晓兵，等.基于AMPK能量调节功能探讨中医实热“上火”的发病机制[J].中华中医药杂志，2018，33（9）：4171-4176.

[21]Banerjee S，Biehl A，Gadina M，et al.JAK-STAT Signaling as a Target for Inflammatory and Autoimmune Diseases：Current and Future Prospects[J].Drugs，2017，77（5）：521-546.

[22]Malemud CJ.The role of the JAK/STAT signal pathway in rheumatoid arthritis[J].Ther Adv Musculoskelet Dis，2018，10（5-6）：117-127.

（2021-07-06收稿 责任编辑：杨觉雄）