基于网络药理学研究复健片治疗缺血性脑卒中的作用机制

朱巍明 刘伟 刘源

摘要 目的：借助网络药理学平台技术探究复健片治疗缺血性脑卒中（IS）的作用机制。方法：利用中药系统药理学与分析平台（TCMSP）、中医药综合数据库（TCMID）、Batman-TCM数据库筛选出复健片中何首乌、桑寄生、决明子、淫羊藿、海马的活性成分及其靶点;利用Uniprot数据库对复健片中靶点信息进行校对;运用GeneCards数据库获取IS的疾病靶点基因;通过Cytoscape 3.7.2软件及STRING 11.0数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并进行生物富集分析。结果：获取复健片治疗IS的共45个活性成分和144个靶点，关键靶点涉及IL6、IL1β、TNF、VEGFA、NOS3等;IS相关靶点1 485个;获得300条GO生物过程和84条相关信号通路，涉及PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、核因子κB信号通路等。结论：复健片是通过多成分、多靶点、多通路相互作用的机制来达到治疗IS的目的，通过本研究为复健片面向临床进一步推广应用提供理论支持，并为未来研究提供思路。

关键词 中医药;复健片;缺血性脑卒中;网络药理学;蛋白质;靶点;机制;通路

Abstract Objective：To investigate the mechanism of Fujian Tablets in the treatment of ischemic stroke（IS） with the help of Internet pharmacology platform technology.Methods：TCMSP，TCMID and Batmann-TCM databases were used to screen the active components and their targets of Polygonum multiflorum，sangjis-heng，Cassia obtusifolia，epimedium and hippocampus in Fujian Tablets;the target information in Fujian T-ablets was proofread by UniProt database; the disease target genes of IS were obtained by GeneCard-s database; Cytoscape 3.7.2 software and STRING 11.0 database were used to construct PPI network and conduct bio-enrichment analysis.Results：A total of 45 active components and 144 targets were obtained，including IL6，IL1 β，TNF，VEGFA，NOS3，etc.; 1485 IS related targets; 300 GO biological processes and 84 related signal pathways were obtained，involving PI3K-AKT signaling pathway，TNF signaling pathway，cGMP-PKG signaling pathway，cAMP signaling pathway，NF-κB signaling pathway，etc.Conclusion：Fujian Tablet through the mechanism of multi-component，multi-target，multi-channel interaction can achieve the purpose of treating IS.This research provides theoretical support for the further clinical application of Fujian tablets，and provides ideas for future experimental research.

Keywords Traditional Chinese medicine; Fujian tablet; Ischemic Stroke; Network Pharmacology; Protein; Target; Mechanism; Pathway

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.010

缺血性脑卒中（Ischemic Stroke，IS）具有高发病率、高致死率、高致残率和高复发率的特点，是全球第二大致死类疾病[1]，严重影响患者生命质量，带来巨大的经济和社会负担。IS属于中医“中风”的范畴，肝肾阴虚是其发病的基础且贯穿疾病全过程。复健片是全国名中医王新陆教授多年临床总结的经验方，以滋补肝肾为主，弥补了祛风化痰活血药物辛温燥烈之不足，临床疗效显著。前期基础研究表明，复健片可增加局部脑血流量，改善血脑屏障功能，上调GAP-43的表达，促进神经轴突生长，从而改善大脑中动脉闭塞（ Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）大鼠运动功能[2-3]，但因中药复方的复杂性，其治疗IS的潜在机制尚未完全明确。我们运用网络药理学技术预测和分析复健片治疗IS的药效成分和相关靶点，探讨其作用机制，为复健片进一步开发利用及基础研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 复健片化学成分的收集 通过中药系统药理学与分析平台（TCMSP）、中药分子机制的生物信息学分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，Batman-TCM）、中医药综合数据库（TCMID），分别以“桑寄生”“何首乌”“海马”“决明子”“淫羊藿”为关键词检索复健片中的化合物成分。以药物动力学原理為基础，以口服药物生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选条件[4]，筛选活性成分。

1.2 复健片靶点筛选及“药物-化合物-靶点”网络构建 在TCMSP中检索并筛选复健片活性成分及其相对应的靶点，借助Uniprot数据库（Universal Protein）对靶点的基因名称进行校正[5]。将靶点蛋白导入Cytoscape3.7.2软件构筑“药物-化合物-靶点”网络并进行分析。

1.3 复健片治疗缺血性脑卒中的潜在作用靶点预测 在人类基因数据库（GeneCards）中以“Ischemic Stroke”为关键词进行检索，对疾病相关的基因进行筛选，将其与1.2项下筛选得到的复方靶点相互映射，获得IS疾病的潜在靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建与分析 将1.3项下筛选得出复健片可能具有治疗IS作用的潜在作用靶点输入STRING 11.0数据库，规定种属为“Homo Sapiens”（人类），得到PPI关系并将数据保存为TSV格式文件。将所得文件导入到Cytoscape3.7.2 软件中构建PPI网络并分析筛选核心靶点。

1.5 靶点富集分析 为深入了解上述筛选出的复健片治疗IS的潜在作用靶点基因的功能以及在信号通路中的作用，利用ClueGO插件进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析，DAVID数据库（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID）进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，设置P<0.05，将物种定义为“Homo Sapiens”。按照其富集的靶点数目进行排序，选取KEGG通路前20个条目进行可视化。

2 结果

2.1 复健片中活性成分的筛选 通过TCMSP、Batman-TCM、TCMID数据库得到复健片中化合物共271个，其中18个来自何首乌（Batman-TCM數据库获取），130个来自淫羊藿，9个来自海马（TCMID数据库中获取），46个来自桑寄生，68个来自决明子。根据OB≥30%且DL≥0.18的标准，筛选得出复健片的活性化合物共45个，其中5个来自何首乌，23个来自淫羊藿，1个来自海马，2个来自桑寄生，14个来自决明子。见表1。

2.2 “药物-化合物-靶点”网络分析 分析网络中包含188个节点（其中药物节点5个，活性化合物节点45个，有6个未涉及网络构建，以及144个靶点节点）及802条边。网络中菱形代表复健片中的药物，三角形代表复方活性化合物，靶基因用方形表示。在网络中，每条边表示节点与节点之间的互作关系。度值表示节点与其他节点的连接数目，运用“Network analyze”插件进行分析。根据活性化合物的等级值和中心度值筛选可知，排名前5位的分别为MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000449-豆甾醇、MOL000006-木犀草素、MOL000471-芦荟大黄素，可与89、56、44、42、33个靶基因相互作用。在靶点中，取排名前5位的靶点，分别是ESR1、AR、PTGS2、NCOA2、DPP4，分别能与31、30、29、24、24个活性化合物相互作用。见图1。

2.3 复健片治疗缺血性脑卒中核心靶点预测及筛选 运用GeneCards数据库检索的靶点共筛选得到1 485个IS的潜在靶点，运用Venny 2.1在线工具绘制复健片活性成分靶点和IS靶点的韦恩图，得到交集靶点共92个，即为预测复健片治疗IS的潜在靶点。见图2。

2.4 复健片治疗缺血性脑卒中的核心靶点预测及分析 将筛选得到的92个潜在靶点输入STRING 11.0数据库中，得到PPI网络。借助Cytoscape 3.7.2软件构建PPI网络。见图3。其中共包含90个节点，971条边。按照度值高低降序排列，取排名前10位的靶点。见表2。

2.5 富集分析 通过ClueGO插件分析得到409个GO富集条目（P<0.05），其中包括44类细胞组分（Cell Component，CC）、65种细胞功能（Molecular Function，MF）和300个生物过程（Biological Processes，BP）。其中BP方面主要涉及信号转导、积极调控细胞增殖、对缺氧的反应、凋亡过程的负调控、氧化还原过程、老化、血管生成、化学突触传递、MAPK活性的激活、蛋白水解凋亡等过程。MF方面，在蛋白质结合、蛋白质均二聚活性、酶结合、锌离子结合、丝氨酸型内肽酶活性、受体结合、序列特异性DNA结合、钙离子结合、药物结合等富集较为显著。见图4。

通过DAVID数据库共筛选得到KEGG通路84条（P<0.05），主要涉及神经活性配体-受体相互作用、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、鞘脂信号通路、多巴胺能突触、Rap1信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路、VEGF信号通路、核因子κB信号通路等。富集基因数排名前20的通路利用气泡图进行可视化。见图5～6。

3 讨论

缺血性脑卒中发病原因、病理过程及相关机制复杂多样，长期以来缺乏有效的治疗措施。中药复方具有多靶点、多成分、多功效等优势，可针对卒中发生、发展的不同过程发挥疗效[6-7]。前期临床研究发现，复健片可促进下丘脑分泌和释放多巴胺和去甲肾上腺素，通过神经-内分泌系统改善IS患者神经功能缺损状态[8]，同时研究发现，复健片可促进皮质脊髓束的重塑，改善患者运动功能[9]。基础研究证明，复健片可促进MCAO大鼠受损脑组织的局部血流量改善，上调胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，增强星形胶质细胞活性[10]，同时证明复健片可抑制MCAO大鼠大脑皮质及颈髓Nogo-A的表达，上调GAP-43的表达，诱导神经元轴突再生，促进皮质脊髓束重建[2]。

为了进一步研究复健片治疗缺血性脑卒中的药效基础及潜在的生物学机制，我们利用网络药理学平台技术，筛选网络中等级值和中心度值较为显著的节点，所得节点在网络中可能起到关键作用[4]。因此这种在活性化合物与靶点之间的多重对应关系体现了中药复方的复杂性，同时各成分与靶点之间相互作用可能是中药复方发挥整体性治疗的体现。通过筛选复健片271个化合物，获得45个活性成分，筛选药效靶点，获得92个疾病与药物交集靶点，构建PPI网络，基因靶点富集分析及通路预测等手段，得到4个相关重要成分，分别是槲皮素、山柰酚、豆甾醇、木犀草素。其中槲皮素可与89个靶点蛋白发生作用，可见其是治疗缺血性脑卒中关键成分。槲皮素具有神经保护、抗氧化、抗炎的作用，广泛应用于脑及脊髓损伤的动物模型中[11-13]，并得到不错的疗效。易波和戴宜武[14]认为槲皮素可以通过保护神经元及线粒体功能来减轻脑卒中后带来的继发性损害。槲皮素神经保护功能已得到广泛应用，但槲皮素的药理机制研究仍在深入，其临床使用价值还在不断进行探索。而山柰酚同样也具有抗炎、抗氧化的作用，且可显著降低缺血再灌注脑组织局部氧自由基水平，减少细胞凋亡，从而保护脑组织[15]。豆甾醇属植物甾醇的一种，其在抗炎、抗氧化及中枢神经系统保护方面都发挥作用[16];有研究表明，植物甾醇亦在调节血脂，降低胆固醇等方面发挥重要作用[17]。木犀草素具有抗氧化、抗炎及抗过敏活性等作用[18-19]。乔会敏等[20]通过动物实验证明木犀草素可改善MCAO大鼠神经功能缺失，减轻脑水肿，减小脑梗死的体积。

根据复健片治疗缺血性脑卒中的PPI网络结果分析得出90个靶点，通过分析发现IL6、IL1β、VEGFA、TNF、NOS3等靶点可能是复健片治疗缺血性脑卒中的关键靶点。白细胞介素-6（IL-6）主要由活化的单核细胞产生，当机体发生炎症反应时，单核细胞最早活化并产生IL-6，其是多功能性的，具有促进炎症发生及抗炎的双重作用，在颅脑损伤及感染等情况发生时，IL-6表達水平上升，加重炎症反应，而在生理状态下，IL-6可维持和调节神经细胞的生长[21-22]。白细胞介素-1β（IL-1β）也属于白细胞介素一种，有研究表明，下调其表达可抑制炎症反应，改善缺血性再灌注后的脑损伤[23]。肿瘤坏死因子（TNF）亦具有双向调节，在脑缺血发生后水平显著上升，从而诱发炎症反应和细胞凋亡，导致脑水肿、脑梗死等病变，而其也可增加脑组织对缺血的耐受程度[24]，其机制复杂尚待进一步探索。在血管发成与形成过程中，血管内皮生长因子A（VEGFA）发挥着重要作用，杨冀萍和刘新峰[25]认为血管内皮生长因子在脑缺血损害时具有神经保护作用，降低缺血性损伤，促进神经功能的恢复，其应用可促进血管芽生，实现缺血区的再灌注。动物实验也表明，血管内皮生长因子可诱导缺血动物模型缺血区血管生成，趋化室管膜下区新生神经元向缺血区迁移[26]。此外，一氧化氮合酶（NOS）与脑卒中的研究目前较少，NOS3属NOS的一种，又称为内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS），有研究表明，其与脑缺血的发生相关[27]，仍须进一步研究。环氧合酶2（COX2）在MCAO大鼠模型中的表达相比假手术组显著升高，而且COX2的表达升高，可诱发炎症反应，参与脑缺血的损伤，而COX2表达的减少有助于MCAO大鼠神经功能的恢复[28-29]。

通过复健片治疗缺血性脑卒中的靶点GO富集分析得出，信号转导、调控细胞增殖、凋亡过程的负调控、氧化还原过程、血管生成、蛋白水解凋亡等生物过程可能发挥主要作用，在复健片抗缺血性脑卒中的治疗中这些过程显得较为重要。KEGG富集通路分析得出，复健片治疗缺血性脑卒中的潜在靶点主要涉及神经活性配体-受体相互作用、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、核因子κB信号通路等。进一步分析发现，复健片治疗缺血性脑卒的疗效是否来源于与脑缺血关联较为密切的PI3K-AKT信号通路、cGMP-PKG信号通路、核因子κB信号通路，仍须进一步的实验研究。其中，PI3K-AKT信号通路通过分析发现其应用广泛，且通路较为复杂。目前研究发现，PI3K-AKT信号通路与脑缺血发生后细胞的凋亡有密切关系，多种神经营养因子、缺血后处理及中药通过激活PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡来实现神经的营养及保护作用[30-31]。而核因子κB信号通路的激活与靶点基因IL6及TNF合成与释放有着直接的联系。此外，有研究表明，cGMP-PKG信号通路参与调节神经发生及细胞增殖过程并发生重要作用[32]，同时激活cGMP-PKG信号通路可促进神经发生，改善缺血后小鼠的神经结构和功能[33]。

综上所述，采用网络药理学的研究方法证明复健片治疗缺血性脑卒中具有多成分、多靶点、多通路的特点，并从多个角度探讨复健片治疗缺血性脑卒中的潜在作用机制及靶点，并为复健片的临床应用提供理论支持，同时为复健片的进一步实验研究提供思路。但本研究仍有一定的局限性，由于数据库的数据及相关文献有限，所预测得出复健片治疗靶点所展示的相关通路，其机制研究仍需进一步深入研究。

参考文献

[1]Benjamin EJ，Blaha MJ，Chiuve SE，et al.Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update：A Report From the American Heart Association[J].Circulation，2017，135（10）：e146-e603.

[2]王新陆，王中琳，周永红.下调脑区的激活及其中药作用机制的研究[J].中医药学刊，2004，22（8）：1365-1367.

[3]刘维，英振昊，张国丽，等.从Nogo-A-NgR信号通路探讨MCAO大鼠皮脊髓束重塑的启动及复健片干预机制[J].中风与神经疾病杂志，2019，36（10）：896-901.

[4][1]刘源，刘金豹，彭伟.人参败毒散治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）作用机制的网络药理学探讨[J].中药材，2020，43（6）：1531-1539.

[5]刘源，许波，刘金豹，等.独活寄生汤治疗膝骨性关节炎分子机制的网络药理学探讨[J].海南医学院学报，2020，26（16）：1242-1249.

[6]张艾嘉，王爽，王萍，等.缺血性脑卒中的病理机制研究进展及中医药防治[J].中国实验方剂学杂志，2020，26（5）：227-240.

[7]管欣，张瑶，李洪超.注射用尤瑞克林与丁苯酞氯化钠注射液治疗轻-中度急性缺血性脑卒中的成本效用分析[J].中国新药杂志，2020，29（6）：715-720.

[8]韩萍，于春蕾，张娜，等.滋补肝肾中药调控神经-内分泌系统治疗脑梗死的临床研究[J].中医临床研究，2016，8（27）：38-40.

[9]李鑫，刘伟，秦玲.复健片促进皮质脊髓束重塑的临床观察[J].北京中医药大学学报，2017，40（1）：70-76.

[10]刘伟.复健片对MCAO大鼠脑组织GFAP表达及局部脑血流量的影响[J].中华中医药学刊，2009，27（1）：49-51.

[11]Schültke E，Kendall E，Kamencic H，et al.Quercetin promotes functional recovery following acute spinal cord injury[J].J Neurotrauma，2003，20（6）：583-591.

[12]Lee JK，Kwak HJ，Piao MS，et al.Quercetin reduces the elevated matrix metalloproteinases-9 level and improves functional outcome after cerebral focal ischemia in rats[J].Acta Neurochir（Wien），2011，153（6）：1321-1329.

[13]Kinaci MK，Erkasap N，Kucuk A，et al.Effects of quercetin on apoptosis，NF-κB and NOS gene expression in renal ischemia/reperfusion injury[J].Exp Ther Med，2012，3（2）：249-254.

[14]易波，戴宜武.槲皮素對脑卒中神经损伤修复的研究进展[J].中华神经创伤外科（连续型电子期刊），2016，2（3）：181-183.

[15]何煜舟，丁美萍，汪云开，等.山萘酚对缺血再灌注脑损伤大鼠的保护作用[J].中华中医药学刊，2009，27（8）：1673-1675.

[16]汪帅，孙宇，李春梅，等.豆甾醇的研究进展概述[J].中国药业，2019，28（23）：96-98.

[17]卢婧霞，郑祖国，徐志猛，等.植物甾醇降血脂机制研究进展[J].中国中药杂志，2019，44（21）：4552-4559.

[18]Shimoi K，Masuda S，Furugori M，et al.Radioprotective effect of antioxidative flavonoids in gamma-ray irradiated mice[J].Carcinogenesis，1994，15（11）：2669-2672.

[19]Yamamoto H，Sakakibara J，Nagatsu A，et al.Inhibitors of arachidonate lipoxygenase from defatted perilla seed[J].J Agric Food Chem，1998，46（3）：862-865.

[20]乔会敏，陈林玉，杜媛媛，等.木犀草素对大鼠缺血性脑组织上调Nrf2、Bcl-2下调Bax的表达[J].脑与神经疾病杂志，2017，25（11）：672-676.

[21]Song L，Pei L，Yao S，et al.NLRP3 Inflammasome in Neurological Diseases，from Functions to Therapies[J].Front Cell Neurosci，2017，11：63.

[22]陈笑兰，王阳，曾其毅.白细胞介素-6及其信号通路在中枢神经系统感染中的作用研究进展[J].中国实用儿科杂志，2019，34（4）：305-308.

[23]刘俊伟，任冶龙，刘旭玲，等.人参皂苷Rb1对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积及脑组织和血清IL-1β的影响[J].中国中西医结合杂志，2013，33（12）：1696-1700.

[24]何婵，罗华丽，季晖.基于TNF-α的脑缺血再灌注损伤机制及相关药物研究进展[J].中国药房，2016，27（28）：4016-4020.

[25]杨冀萍，刘新峰.血管内皮生长因子治疗性血管生成作用与缺血性脑血管病[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（7）：1354-1359.

[26]Wang Y，Jin K，Mao XO，et al.VEGF-overexpressing transgenic mice show enhanced post-ischemic neurogenesis and neuromigration[J].J Neurosci Res，2007，85（4）：740-747.

[27]朱殊，江顺福，曹铭华，等.NOS3基因多态性与血脂、缺血性脑卒中的相关性研究[J].中风与神经疾病杂志，2019，36（8）：697-700.

[28]房亚兰，黄语悠，赵咏梅，等.大黄酚对局灶性脑缺血再灌注小鼠缺血半暗带区环氧化酶2和基质金属蛋白酶-9表达的影响[J].首都医科大学学报，2017，38（1）：47-52.

[29]尹洁，闫峰，李森，等.环氧化酶2参与远隔缺血预适应对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2014，21（3）：166-169.

[30]许艺超，石松生.PI3K/Akt信号通路在脑缺血神经元凋亡中作用的研究进展[J].国际神经病学神经外科学杂志，2012，39（6）：530-533.

[31]吴丹，高耀，向欢，等.PI3K/Akt信号通路在抑郁症及抗抑郁中药作用机制研究中的进展[J].中草药，2019，50（18）：4461-4469.

[32]lmestig J，Marlet IR，Hainsworth AH，et al.Phosphodiesterase 5 inhibition as a therapeutic target for ischemic stroke：A systematic review of preclinical studies[J].Cell Signal，2017，38：39-48.

[33]校欢，马晓娇，承欧梅，等.NO-cGMP-PKG信号通路在天麻素促进脑缺血后海马神经发生中的作用[J].中国中药杂志，2019，44（24）：5451-5456.

（2020-08-20收稿 责任编辑：张雄杰）