银杏酮酯通过抑制钠、钙通道和自发性钙波防治心律失常

刘 备，张光永，刘爱华，张志雄，王星禹

(上海中医药大学基础医学院生理教研室，上海 201203)

心律失常是许多心血管疾病常见症状，易造成循环系统障碍如心输出量下降，动脉血压降低，晕厥，甚至导致心源性猝死[1]。心律失常由冲动发生异常和传导异常引起，冲动发生异常包括异位节律和后除极引起的触发活动(triggered activity，TA)。后除极一旦除极至阈电位水平就触发动作电位导致心律失常。延迟后除极(delayed after depolarization，DAD)是在心肌细胞动作电位4期复极结束后发生的短暂性、并呈现振荡性的除极电活动，又称晚期后除极。DAD通常发生在肌浆网Ca2+浓度异常升高，亦即所谓钙超载时[2]。此时细胞内的Ca2+浓度升高，激活非选择性阳离子通道如钙通道、钠通道，促进Ca2+、Na+内流或Na+/Ca2+交换电流，形成内向电流，导致DAD，引发心律失常。

近年来由于激光共聚焦显微镜和钙荧光染料的普及，研究人员发现自发性钙波(spontaneous Ca2+wave，SCaW)能触发各种心律失常，钙波是指心肌细胞内Ca2+浓度增高、胞内Ca2+在局部的自发性释放增加并发生传导的现象[3]。SCaW激活Na+/Ca2+交换电流(INa/Ca)内向电流，引起DAD，可能导致心律不齐[4]。

银杏酮酯(ginkgo biloba extract 50,GBE50)是我国独立研发的新型银杏叶提取物制剂，其银杏内酯含量>0.06，银杏总黄酮含量>0.44，总黄酮醇苷>0.24，毒性成分银杏酸含量则控制在5 μg·g-1以下。有研究报道在整体水平GBE50具有抗乌头碱、哇巴因引起的大鼠心律失常的作用[5]；另离体心脏灌流实验也显示GBE50能够降低缺血/再灌注导致的室颤的发生率，部分缩短室颤的持续时间[6]。GBE50抗心律失常作用可能是通过抑制异常的电活动(DAD和TA)实现的[5]，但其作用机制尚有待进一步阐明。本研究利用膜片钳技术研究GBE50对乌头碱诱发的心室肌细胞异常钠电流(INa)和L型钙电流(ICa,L)的影响，通过激光共聚焦钙离子成像技术观察GBE50对缺血/再灌注诱导的心室肌细胞自发性钙波的作用，探讨其抗心律失常的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 清洁级SD雄性大鼠，体质量(225±25)g，由上海中科院斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK(沪)012-0002。经上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查，实验符合实验动物福利及伦理相关规范，伦理编号：PZSHUTCM190614008。

1.1.2药品与试剂 Taurine、HEPES、Tetraethylammonium Chloride(TEA-Cl)、MgATP、EGTA、Tris-GTP、2，3-丁二酮一肟(BDM)、Na2-ATP、蛋白酶、乌头碱等试剂购自Sigma公司。Fluo-4-AM购自东仁化学科技有限公司。Ⅱ型胶原酶(Collagenase，Type 2)购自Worthington 公司。Laminin购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。银杏酮酯(GBE50)由上海杏灵制药有限公司提供，批号为：111002。其他试剂均为沪试的分析纯。

1.1.3仪器 IX-70倒置显微镜(日本奥林巴斯光学公司)；MultiClamp 700B膜片钳放大器(美国Molecular Devices公司)；LGF-1B Langendorff 心脏灌流装置(成都仪器厂)；TCS SP8激光共聚焦成像系统(德国Leica 公司)；P-97微电极拉制仪(美国Sutter公司)；SEN-3201电子刺激器(日本NIHON KOHDEN 公司)；PB-10 PH计(德国赛多利斯公司)。

1.1.4溶液配制 Krebs-Henseleit(K-H)改良液配方为(mmol·L-1)：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl21.25，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325.0，Glucose 11.0。无钙缓冲液(mmol·L-1)：NaCl 120，KCl 5.4，NaH2PO41.2，NaHCO320，MgSO41.2，Glucose 5.6，BDM 10，Taurine 5，用稀盐酸将pH调至7.4。在无钙缓冲液中加入10% FBS和12.5 mmol·L-1CaCl2得到停止酶解液。缺血液(mmol·L-1)：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325，2-Deoxy-D-glucose 10，Na2S2O410[7]。KB液(mmol·L-1)：K glutamate 100，KCl 25，MgSO42，KH2PO42，Taurine 20，Creatine base 5，EGTA 0.5，HEPES 5，Glucose 20，加KOH校正pH值至7.4。记录ICa,L外液(mmol·L-1)：NaCl 140，CsCl 10，CaCl21，MgCl21，glucose 10，HEPES 10(加NaOH校正pH值至7.4)。记录ICa,L电极内液(mmol·L-1)：CsCl 130，TEA-Cl 20，MgATP 5，EGTA 5，Tris-GTP 0.1，HEPES 5(用CsOH将pH值调至7.2)。记录INa外液(mmol·L-1)：choline chloride 120，NaCl 25，CsCl 4，CaCl20.1，CoCl22，MgCl21，HEPES 10，Glucose 10(用CsOH将pH值调至7.4)。记录INa电极内液(mmol·L-1)：CsCl 140，NaCl 10，EGTA 5，Na2-ATP 5，HEPES 5(用CsOH将pH值调至7.3)。GBE50母液配制：1.25 g GBE50加入10 mL丙二醇，加热溶解，然后加超纯水至500 mL搅拌溶解，用孔径为0.22 μm的混合纤维素脂膜过滤置于4 ℃冷藏室待用。

1.2 方法

1.2.1细胞分离 通过酶解法获得单个大鼠心室肌细胞。腹腔注射20%乌拉坦5 mL·kg-1麻醉大鼠后，迅速开胸取出心脏，在冰冷的K-H缓冲液中洗去余血，迅速将心脏连于Langendorff灌流装置上，通过主动脉进行逆向灌流。灌流液用 95% O2+5% CO2混合气饱和，温度恒定于37 ℃。先用K-H缓冲液灌流15 min，灌流速度为9 mL·min-1；然后以5 mL·min-1的速度改用无钙缓冲液灌流10 min；再改用含0.05% II型胶原酶、0.01% 蛋白酶、0.1% BSA的无钙缓冲液灌流2 min，最后无钙缓冲液加入CaCl2(50 mmol·L-1)对心脏进行循环灌流至全心松软，取下心脏，剪下心室并剪碎心肌组织，置于摇床中振荡温孵5 min进一步酶解，然后加入5 mL的停止酶解液振荡温孵5 min，可得到50%-60%杆状、表面横纹呈搓衣板状且边缘清晰的耐钙细胞，沉淀后用停止酶解液换去上清两次，然后用KB液孵育室温保存待用。

1.2.2膜片钳技术记录心肌细胞膜通道电流 所用微电极用玻璃毛细管置于玻璃微电极拉制仪拉制而成，冲灌电极内液后，其尖端电阻值为2.5-5 MΩ。吸取上述分离好的细胞滴放入显微工作台上细胞浴槽中，然后用微量恒流泵以1.5 mL·min-1的速度对细胞进行灌流。并选择形态完整、横纹清晰、表面干净规则、无收缩的细胞置于视野下作为实验对象。打开膜片钳实验软件Clampex 10.3，对细胞进行封接，破膜，将串联电阻补偿到80%以上。选择设定好的Clampex采样软件的Protocol，细胞膜电流信号通过膜片钳放大器放大后通过软件进行记录。并观察1 μmol·L-1乌头碱灌流5 min后[8]，各组细胞INa、ICa,L电流的变化。其中INa电流记录方案为：膜电位钳制于-100 mV，指令电压以5 mV为步阶，脉冲持续时间为100 ms，从-80 mV跃至 +25 mV。ICa,L电流记录方案为：膜电位钳制于-40 mV以失活T型钙通道和钠通道，以10 mV为步阶，脉冲持续时间为200 ms，从-50 mV跃至+25 mV，每个指令电压之前有个50 ms的-50 mV 的预脉冲。

1.2.3电刺激诱导钙波 分离好的单个细胞滴加于laminin孵育过的培养皿，弃掉上清液，再用含5 μmol·L-1Fluo-4-AM染料的K-H液孵育15 min。将培养皿固定于激光共聚焦系统的细胞槽中，使用Ar激光在488 nm处激发染料，并检测到波长大于510 nm的荧光发射。正常组对照组(Control组)：K-H液灌流10 min以洗脱染料，开始电刺激10 s(电压10 mV，频率1 Hz或3 Hz)，同时选择xt扫描方式[9]进行线扫(扫描分辨率为：512×1像素，每次线扫时长为1.43 ms)，待电刺激结束后继续线扫记录1 min，以观察记录钙波发生情况。缺血/再灌注组(IR组)或加药组(IR+GBE50组)：先用K-H液或加药K-H液灌流10 min以洗脱染料，改用缺血液或加药缺血液灌流4 min，再用K-H液或加药K-H液再灌流3 min，然后开始电刺激10 s，同时进行线扫，待电刺激结束后继续线扫记录1 min，以观察记录钙波发生情况。

2 结果

2.1 GBE50对乌头碱灌流的心肌细胞INa电流的作用乌头碱(1 μmol·L-1)使心肌细胞INa最大电流密度从(-25.94±2.10)pA/pF增至(-37.21±4.23)pA/pF(P<0.05)，使INa激活曲线左移，半激活电压从(-44.07±0.92)mV变为(-49.52±0.81)mV(P<0.01)；而25 mg·L-1GBE50使该模型的INa最大电流密度减小至(-27.11±2.18)pA/pF(P<0.05)，激活曲线右移，半激活电压改变为(-46.33±1.19)mV(P<0.05,Fig 1)。

2.2 GBE50对乌头碱灌流的心肌细胞ICa,L电流的作用使用L型钙通道特异性阻断剂Nifedipine(10 μmol·L-1)能明显阻断记录到的电流，证明记录到的正是ICa,L电流(Fig 2A)。

乌头碱(1 μmol·L-1)使心肌细胞ICa,L最大电流密度从(-3.79±0.27)pA/pF增至(-5.01±0.26)pA/pF(P<0.01)，使ICa,L激活曲线左移，半激活电压从(-16.22 ± 0.81)mV变为(-23.67±0.85)mV(P<0.01)；而25 mg·L-1GBE50使该模型的ICa,L最大电流密度减小至(-3.81± 0.24)pA/pF(P<0.01)，激活曲线右移，半激活电压改变为(-20.84±0.82 mV)(P<0.05,Fig 2B-H)。

Fig 1 GBE50 inhibited aconitine-induced increase in sodium current in rat ventricular cells n=12-14)A:INa recorded for the control;B:INa recorded in the Aco group;C:INa recorded in Aco+GBE50 group;D:Current density-voltage curves for INa in different groups;E:Recording protocol of INa;F:INa Steady-state activation curves;G:Half activation potential of different groups;.Aco:aconitine;*P<0.05,**P<0.01 vs Aco group

Fig 2 GBE50 inhibited aconitine-induced increase in calcium current in rat ventricular cells n=8)A:Nifedipine block of ICa,L；B：ICa,L recorded for the control;C:ICa,L recorded in the Aco group;D:ICa,L recorded in Aco+GBE50 group;E:Current density-voltage curves for ICa,L in different groups;F:Recording protocol of ICa,L;G:ICa,L Steady-state activation curves;H:Half activation potential of different groups;Aco:aconitine;*P<0.05,**P<0.01 vs Aco group

2.3 GBE50对缺血/再灌注心肌细胞的自发性钙波的影响使用1 Hz频率刺激大鼠缺血/再灌注心肌细胞10 s诱导产生自发性钙波，IR组钙波的发生率明显高于Control组，由12.50%上升至81.25%(P<0.01)；25 mg·L-1GBE50未引起正常心肌细胞钙波的发生，可降低IR组的钙波发生，将钙波发生率降低至26.67%(P<0.01,Fig 3A,C)。

使用3 Hz频率刺激大鼠缺血/再灌注心肌细胞10 s诱导产生自发性钙波，IR组钙波的发生率明显高于Control组，由20.00%上升至90.00%(P<0.01)；25 mg·L-1GBE50可降低IR组的钙波发生，将钙波发生率降低至30.00%(P<0.01,Fig 3B，D)。

Fig 3 25 mg·L-1 GBE50 inhibited increase of SCaWs during ischemia-reperfusion in rat ventricular myocytes (n=10-15)A:SCaWs was induced by applying depolarizing pulses at 1 Hz;B:SCaWs was induced by applying depolarizing pulses at 3 Hz;C:Percent of cells with SCaWs at 1 Hz (n=15);D:Percent of cells with SCaWs at 3 Hz (n=10);**P<0.05 vs Control group,##P<0.01 vs IR group

3 讨论

乌头碱可导致整体或细胞水平的“心律失常”，已被广泛用作诱导各种心律失常模型、筛选抗心律失常药物的工具药[10]。有文献报道乌头碱能够延长心肌细胞钠通道的开放，促进Na+向细胞中的渗透[8]，并可增加ICa,L离子流[11]。乌头碱诱导的胞内Na+浓度的增加会促进Na+/Ca2+双向交换[12]，和ICa,L促进Ca2+内流可共同导致细胞内钙超载，从而引起DAD，同时胞内Na+浓度的增加并导致细胞持续的去极化即触发活动(TA)。上述过程构成了乌头碱的致心律失常作用的电生理基础。本文对INa和ICa,L进行激活动力学分析，发现乌头碱使INa和ICa,L激活曲线左移，半激活电压绝对值增加，说明乌头碱灌流心肌细胞后INa和ICa,L内向电流被激活增强。而25 mg·L-1GBE50使该模型的INa和ICa,L最大电流密度减小，激活曲线右移，半激活电压减小，提示GBE50明显抑制乌头碱激活的INa和ICa,L，可能是GBE50抑制异常的电活动(DAD和TA)抗心律失常的机制。

临床上大多数的抗心律失常药物都是通过改变心肌细胞动作电位不同时期的离子通道开放状态和离子流而发生作用的。近年来发现抗心律失常药物本身有时也会引起心律失常，如Ιa类药物中度阻断钠通道，使Q-T间期延长，可引起致死性的尖端扭转性室速的发生。鉴于单通道抗心律失常药物具有致心律失常的不良反应，有学者提出最佳靶点学说：细胞膜上的钠、钾、钙离子通道与心律失常发生、发展密切相关，一个理想的抗心律失常药物会对其中的至少两个通道起作用[13]。理想的抗心律失常药物应该作用于多通道靶标和非离子通道靶标[14]。1 Hz电刺激下GBE50未能引起正常心肌细胞自发性钙波的发生，说明GBE50的抗心律失常作用是安全的。GBE50对心肌非选择性阳离子通道如钠、钙离子通道均有作用，抑制钙超载治疗心律失常，致心律失常的风险降低，符合“最佳靶点学说”的要求。

缺血/再灌注后由于钙释放和回摄通道的异常作用，导致细胞内钙循环的紊乱，表现为胞质内钙超载从而促进肌浆网钙超载，产生肌浆网的钙泄漏引起舒张期自发性钙释放即钙波，可诱导DAD的活动，从而引发再灌注性心律失常[15]。我们之前有发现模拟缺血能诱发心室肌细胞内游离钙浓度增加，GBE50可减轻缺血后钙超载[16]。本文采用含有2-脱氧-D-葡萄糖和连二亚硫酸钠的无糖K-H液[7]模拟缺血灌流心室肌细胞4 min，再用K-H液复灌3 min，制备模拟缺血/再灌注模型，观察自发性钙波产生。结果发现1 Hz和3 Hz电刺激心室肌细胞尚能发生收缩和钙瞬变，停止刺激后能观察到Ca2+在局部的自发性释放增加并伴传导即自发性钙波的发生。GBE50可抑制缺血/再灌注心肌细胞自发性钙波的发生，提示GBE50可能通过抑制心肌缺血导致的钙超载，减少肌浆网的钙泄漏，阻止DAD的发生从而减轻再灌注性心律失常。

自发性钙波产生的机制尚不清楚，在数学模型中它们的出现与肌浆网的兰尼碱受体(ryanodine receptors,RyRs)的活性有关[3]。肌浆网钙释放有两条不同的机制：一是通过由L型钙通道和RyRs共定位形成的所谓钙释放单位，也就是经典的钙诱导的钙释放途径[17]。另一种不依赖于L型钙通道和RyRs的耦联，由随机开放的一个或几个RyRs引起钙的释放。上述两种情况下局部的钙释放都可以通过钙敏感探针将胞内Ca2+可视化而记录到钙火花(Ca2+sparks)。GBE50对钙火花即肌浆网的钙泄漏是否有影响及其机制还亟待探索。