TGF-β1调控Cdk5表达在人肾系膜细胞外基质沉积中的作用

周 毅，杨亚坤，康 平，柳 丹，夏顺杰，张 悦，刘 巍

(河北医科大学 1.第二医院、2.病理学教研室、3.诊断学教研室，河北 石家庄 050017)

慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)可导致渐进性、不可逆性的肾单位丢失和肾组织损伤，继而出现肾功能障碍，并最终进展至终末期肾功能衰竭(end-stage renal disease，ESRD)。肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病发生、发展的中心环节和重要特征，是其进展至ESRD的共同通路之一[1-2]。早期明确诊断并采取针对性治疗，可有效延缓肾脏纤维化的发生和进展。但是，一直以来，由于纤维化的诊断缺乏早期、精准的特异性标志物，使得其治疗亦缺乏针对性。因此，阐明其发病机制，对于预防及早期干预疾病的发生发展具有重要意义。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一类重要的致纤维化生长因子，其家族成员TGF-β1在肾脏细胞中有广泛表达，可通过抑制细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解，在肾间质基质沉积中发挥重要作用。细胞周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)作为一种蛋白激酶，通过磷酸化相应底物发挥其生理学作用。本课题组前期研究发现，高糖、TGF-β1等因素，可导致p35断裂为p25，继而激活Cdk5，使其激酶活性异常升高，在糖尿病肾病足细胞损伤及凋亡的发生、发展过程中发挥重要作用[3-4]。本文在此基础上，以人肾小球系膜细胞为研究对象，重点探讨TGF-β1调控Cdk5表达在系膜细胞外基质沉积中所起的作用，以期进一步明确TGF-β1促进肾脏纤维化的作用机制，为探索肾脏纤维化的有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验试剂 DMEM/F12培养基(Gibco)、胎牛血清(Gibco，No.10100147)。TGF-β1(MCE，HY-P7118)，Roscovitine(Abcam，ab141847)，0.25%胰蛋白酶(Solarbio，No.T1300)。DN-Cdk5质粒(Addgene，#1871)。兔抗Cdk5单克隆抗体(Abcam，ab40773)，兔抗p35/25多克隆抗体(CST，#2680)，兔多克隆Collagen Ⅳ抗体(Proteintech，No.55131-1AP)、鼠单克隆FN抗体(Proteintech，No.66042-1-Ig)，FITC标记羊抗鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，115-095-003)，Cy3标记羊抗兔IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，111-165-003)。PCR引物(上海生工)，Real time-PCR试剂盒(TaKaRa Biotechnology，RR820A)。

1.1.2细胞 人肾小球系膜细胞(HMC)为本实验室冻存细胞，复苏、传代后备用。

1.1.3仪器设备 CO2培养箱(美国Thermo Scientific)，恒温孵育箱(天津泰斯特)，超低温冰箱(青岛海尔)，高速低温离心机(德国Eppendorf)，电泳槽、电泳仪(美国Bio-Rad)，光学显微镜、荧光显微镜(日本Olympus)，荧光实时定量PCR仪(美国Agilent)，Odyssey FC成像仪(美国Li-COR Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1细胞分组

1.2.1.1 TGF-β1对Cdk5蛋白及mRNA表达的影响 HMC接种于6孔板，10 μg·L-1的TGF-β1分别刺激0、3、6、12、24 h，Western blot、免疫荧光化学法检测Cdk5、p35/25蛋白表达情况，Real time-PCR检测Cdk5 mRNA表达。

1.2.1.2 Cdk5对系膜细胞FN、Collagen Ⅳ表达的影响 转染Cdk5过表达质粒，并设置空白对照组和质粒对照组，Western blot、免疫荧光化学法检测FN、Collagen Ⅳ蛋白表达情况。

1.2.1.3 Cdk5抑制剂Roscovitine对TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表达的影响 细胞随机分为Control组、TGF-β1刺激组(10 μg·L-1的TGF-β1刺激24 h)，TGF-β1+Roscovitine组(10 μg·L-1的TGF-β1和10 μmol·L-1Roscovitine混合培养基刺激24 h)，Western blot、免疫荧光化学法检测FN、Collagen Ⅳ蛋白表达情况，Real time-PCR检测FN、Collagen Ⅳ mRNA的表达。

1.2.1.4 Cdk5干扰质粒对TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表达的影响 细胞随机分为Control组、TGF-β1+质粒对照Vector组，TGF-β1+DN-Cdk5组。TGF-β1+Vector组和TGF-β1+DN-Cdk5组，分别转染相应质粒24 h后，再给予TGF-β1(10 μg·L-1)刺激24 h，Western blot、免疫荧光化学法检测FN、Collagen Ⅳ蛋白表达情况，Real time-PCR检测FN、Collagen Ⅳ mRNA的表达。

1.2.2质粒构建与细胞转染 Cdk5过表达质粒和干扰质粒购自Addgene公司。1×108·L-1密度的HMC接种于6孔板，待其生长至约80%密度时，准备转染。将3 μL FuGENE HD、1 μg质粒溶于100 μL不含血清与抗生素的培养基中，混匀，室温静置15 min，加入6孔板中，轻摇，培养6-8 h后改为普通培养基培养。

1.2.3Western blot检测相关蛋白表达 收集细胞，提取总蛋白，BCA法定量。取50 μg总蛋白，加6×上样缓冲液，100 ℃变性5 min，SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，分别加入Cdk5(1 ∶500)、p35/25(1 ∶1 000)、FN(1 ∶1 000)、Collagen Ⅳ(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)抗体，4 ℃孵育过夜。洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的IgG(1 ∶5 000)，37 ℃孵育2 h。TTBS洗膜，滴加ECL发光剂，于Odyssey FC成像系统中显影，并对条带进行定量分析。以目的条带和β-actin条带积分光密度值比值代表目的蛋白的相对表达量。

1.2.4Real time-PCR检测相关mRNA表达 TRIzol法提取细胞总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，NanoDrop 1000微量核酸蛋白检测仪测定RNA纯度。按照PrimeScriptTMRT regent Kit说明书进行反转录。取2 μL cDNA产物作为PCR反应模板，荧光实时定量PCR仪检测相关mRNA的表达。Cdk5引物：上游5′-CTTAGGTGACGGCCCATAGT-3′，下游5′-GTAACCTGCCACTTCCACCT-3′；FN引物：上游5′-GAGCTATTCCCTGCACCTGATG-3′，下游5′-CGTGCAAGGCAACCACACT-3′；Col Ⅳ引物：上游5′-GATGGCCAGAAAGGACCAGT-3′，下游5′-GGGATTCGGGGACAGTCATC-3′；18S引物：上游5′-CATTCGAACGTCTGCCCTATC-3′，下游5′-CCTGCTGCCTTCCTTGGA-3′。扩增条件：95 ℃变性15 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 1 min，45个循环，以18S作内参基因，用△△Ct法分析基因的相对表达。

1.2.5免疫细胞荧光法检测相关蛋白的表达 从处理好的细胞培养板底部取出盖玻片，4%多聚甲醛固定；0.3%的Triton X-100打孔；血清封闭，37 ℃孵育；加入相应抗体Cdk5(1 ∶50)、p35/25(1 ∶100)、FN(1 ∶100)、Collagen Ⅳ(1 ∶100)，4 ℃过夜。滴加带FITC或Cy3标记的二抗(1 ∶50或1 ∶100稀释)，37 ℃避光孵育；用含DAPI的防荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察相应蛋白的表达情况并照片。

2 结果

2.1TGF-β1对系膜细胞Cdk5、p35/p25表达的影响 TGF-β1(10 μg·L-1)作用于肾小球系膜细胞0、3、6、12、24 h后，随着刺激时间的延长，Western blot检测Cdk5蛋白表达呈时间依赖性增加。p35/p25是Cdk5的特异性协同激动剂，TGF-β1作用后，其蛋白表达与Cdk5一致，也呈时间依赖性增加(Fig 1A)。Real time-PCR法检测TGF-β1作用于系膜细胞0、12、24 h后，Cdk5 mRNA表达的变化。与0 h相比，TGF-β1作用12 h、24 h后，Cdk5 mRNA均明显增加(P<0.01，Fig 1B)，作用24 h时，Cdk5 mRNA增加约6.82倍。

Fig 1 Effect of TGF-β1 on expression of Cdk5 and p35/p25 in human mesangial cells n=6)A:Western blot;B:Real time-PCR；*P<0.05,**P<0.01 vs 0 h group;TGF-β1:10 μg·L-1

2.2 Cdk5对系膜细胞FN、Collagen Ⅳ表达的影响与空白对照组和空白质粒转染组相比，转染Cdk5过表达质粒后，Western blot检测FN、Collagen Ⅳ蛋白表达均明显增高(P<0.01，Fig 2A、B)；免疫荧光结果也显示，转染Cdk5质粒后，FN(绿色荧光)、Collagen Ⅳ(红色荧光)蛋白表达明显增强(P<0.01，Fig 2C)。

Fig 2 Effect of Cdk5 on expression of FN and collagen Ⅳ in human mesangial cells n=6)A-B:Western blot;C:Immunofluorescence staining；**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs Vector group

2.3 Cdk5激酶活性抑制剂Roscovitine对TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表达的影响与空白对照组相比，TGF-β1刺激后，Western blot结果显示系膜细胞FN、Collagen Ⅳ蛋白表达均明显增加，而应用Cdk5激酶活性抑制剂Roscovitine后，FN、Collagen Ⅳ表达明显降低(P<0.05，Fig 3A、B)；Real time-PCR结果显示，TGF-β1刺激后，FN、Collagen Ⅳ mRNA表达明显增加，应用Roscovitine后，mRNA表达降低(P<0.05，Fig 3C、D)；免疫荧光结果显示，与对照组相比，TGF-β1刺激后，FN(绿色荧光)、Collagen Ⅳ(红色荧光)表达明显增多，应用Roscovitine干预后，FN、Collagen Ⅳ表达减少(Fig 3E、F)。

Fig 3 Effect of Roscovitine on expression of FN and collagen Ⅳ in HMC stimulated by TGF-β1 n=6)1.Control;2.TGF-β1;3.TGF-β1+Roscovitine.A-B:Western blot;C-D:Real time-PCR;E-F:Immunofluorescence staining；*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TGF-β1 group;TGF-β1:10 μg·L-1;Roscovitine:10 μmol·L-1

2.4 Cdk5干扰质粒对TGF-β1刺激HMC后FN、Collagen Ⅳ表达的影响与对照组相比，TGF-β1加空白质粒转染组，Western blot结果检测系膜细胞FN、Collagen Ⅳ蛋白表达均明显增加，而转染Cdk5干扰质粒后，FN、Collagen Ⅳ表达明显降低(P<0.05，Fig 4A-C)；Real time-PCR结果可见，TGF-β1加空白质粒转染后，FN、Collagen Ⅳ mRNA表达明显增加，转染Cdk5干扰质粒后，mRNA表达降低(P<0.05，Fig 4D、E)；免疫荧光结果显示，与对照组相比，TGF-β1加空白质粒转染组，FN(绿色荧光)、Collagen Ⅳ(红色荧光)表达明显增多，转染Cdk5干扰质粒后，FN、Collagen Ⅳ表达减少(Fig 4F、G)。

Fig 4 Effect of Cdk5 knockdown plasmid on expression of FN and collagen Ⅳ in HMC stimulated by TGF-β1 n=6)1.Control;2.TGF-β1+vector;3.TGF-β1+DN-Cdk5.A-C:Western blot;D-E:Real time-PCR;F-G:Immunofluorescence staining；*P<0.05,**P<0.01 vs Control group;#P<0.05,##P<0.01 vs Vector group;TGF-β1:10 μg·L-1

3 讨论

在我国，慢性肾脏疾病的发病率约为10.8%，正日益成为危害人民身体健康的公共卫生问题之一。肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病的共同病理学特征，主要表现为ECM的大量堆积和肾小管萎缩，并最终导致ESRD。大量研究表明，TGF-β上调与糖尿病肾病、膜性肾病和其他多种慢性肾脏疾病的发生、进展均关系密切，被认为是致肾脏纤维化的关键介质之一，但其具体机制目前尚未完全阐明[5]。

Cdk5是脯氨酸限定性的丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，主要通过磷酸化相应底物发挥其生理学作用。一直以来，关于Cdk5生物学功能的研究多集中于神经系统，认为其在维持神经元正常功能和神经系统发育过程中起了关键作用[6-7]。近年来，考虑到Cdk5及其激活亚基p35在许多神经系统外组织，如胰腺、肾脏、卵巢等部位也有广泛表达，其神经系统外作用逐渐引起关注[8]。有研究报道，在抗肾小球基底膜肾炎模型鼠和HIV转基因鼠肾组织中，Cdk5在增殖和去分化足细胞中的表达明显降低；抑制Cdk5的表达可明显改变体外培养的已分化足细胞的形态，出现胞体延长，足突消失；抑制足细胞中p35的表达可显著增加UV辐射、嘌呤霉素氨基核苷等引起的足细胞凋亡，提示肾脏疾病中足细胞的损伤可能与Cdk5/p35的表达异常有关[9-11]。本课题组前期针对糖尿病肾病足细胞的研究也发现，高糖、TGF-β1等因素，可导致p35断裂为p25，继而激活Cdk5，使其激酶活性异常升高，在足细胞损伤及凋亡的发生、发展过程中发挥重要作用[3-4]。

本研究在此基础上，以人肾小球系膜细胞为研究对象，重点探讨TGF-β1调控Cdk5表达在系膜细胞外基质沉积中所起的作用。我们的研究发现，10 μg·L-1的TGF-β1刺激后，随着时间的延长，系膜细胞Cdk5蛋白及mRNA表达呈时间依赖性增加；作为Cdk5的特异性协同激动剂，p35、p25也呈现出与Cdk5一致的表达趋势，可见TGF-β1作用于系膜细胞后，Cdk5被激活。

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，为了观察Cdk5在肾脏纤维化中所起的作用，我们在系膜细胞中转染了Cdk5过表达质粒，观察其对FN、Collagen Ⅳ表达的影响。研究发现，与空白对照组和空白质粒转染组相比，转染Cdk5过表达质粒后，FN、Collagen Ⅳ蛋白表达均明显增高，可见Cdk5在胶原蛋白合成、细胞外基质沉积中起了促进作用。进一步，我们应用Cdk5激酶活性抑制剂Roscovitine或转染Cdk5干扰质粒，目的是降低Cdk5表达，来观察其在TGF-β1促进细胞外基质合成中所起的作用。结果显示，与对照组相比，TGF-β1刺激后，系膜细胞FN、Collagen Ⅳ蛋白及mRNA表达均明显增加；而无论是应用Roscovitine还是转染Cdk5干扰质粒后，FN、Collagen Ⅳ蛋白及mRNA表达均明显降低，可见Cdk5在TGF-β1促进系膜细胞外基质合成的过程中发挥了重要作用。

关于TGF-β1引起肾脏纤维化的机制，目前较多的研究集中在两个方面：即Smad信号通路和非Smad信号通路[12]。在Smad依赖的信号转导通路中，研究报道，TGF-β1可以通过结合TGF-β受体I(TGF-β receptor I，TβRI)表面的丝/苏氨酸激酶受体发挥其细胞效应，导致锚定蛋白SARA与Smad2/3结合并促进其磷酸化；随后，Smad2/3磷酸化复合物与Smad4形成一高阶复合物并在细胞核内积聚；在细胞核中，活性的Smad2/3/4复合物可以调节a-SMA、胶原IA2、PAI-1和MMP-2等的转录，继而促进上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，导致ECM成分的合成和沉积[13-14]。此外，也有越来越多的证据表明，TGF-β1可以通过Smad信号通路调控多种microRNAs(miRs)，进而促进肾纤维化的进程[15]。而TGF-β1的非Smad通路，可刺激平行的下游信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)途径，细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)1/2、JNK和p38，以及生长和存活激酶，磷酸肌醇-3-激酶(phopshatidylinositol-3-kinase，PI3K)、Akt和小GTP结合蛋白(Ras、RhoA、Rac1和Cdc42)，Notch和Wnt/β-catenin途径等，间接参与EMT、凋亡、分化和基质形成[16]。本课题组前期在对足细胞的研究中发现，TGF-β1可通过ERK1/2通路增强足细胞中Cdk5的表达，而Smads通路并不参TGF-β1 对Cdk5的调节过程[3]。因此，我们推测，在系膜细胞，TGF-β1可能同样通过非Smad通路调节Cdk5的表达，发挥对细胞外基质合成的调控作用，其具体作用机制尚需进一步研究。

综上，我们的研究发现，TGF-β1作用于人肾小球系膜细胞，可激活Cdk5，导致FN、Collagen Ⅳ表达增加。而抑制Cdk5后，可降低FN、Collagen Ⅳ的表达水平。可见，Cdk5在TGF-β1致肾小球系膜细胞细胞外基质沉积中发挥了重要作用。抑制Cdk5表达及激酶活性的异常增高，可能是减缓慢性肾脏病肾小球纤维化的重要手段和治疗靶点。我们的研究进一步明确了TGF-β1促进肾脏纤维化的作用机制，为探索肾脏纤维化的有效防治提供理论依据。