Chidamide诱导的LncRNA ENST00000448869.1靶向作用Nestin抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长

郭亚瑞,周伟强

(沈阳医学院基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110034)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的重要原因。目前，乳腺癌的发病率和死亡率仍在逐年上升，其发生发展的分子机制需要深入地探索[1-2]。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)，由于其侵袭性和缺乏治疗靶点，且雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体2型(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)都是阴性，无特异性治疗靶点，是乳腺癌中一类高度异质性的亚型[3-4]。

近年来，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)在体内、外对实体瘤和血液系统恶性肿瘤显示出良好的抗肿瘤活性[2]。西达苯胺(chidamide)是一种新型口服活性苯甲酰胺类HDACi，选择性抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)1、2、3和10的活性，HDAC 1、2、3和10是参与肿瘤细胞及其周围微环境中肿瘤起始和发展并在其中发挥重要作用的酶。作为一种表观遗传调节剂，Chidamide诱导肿瘤细胞生长停滞和凋亡，并增强细胞抗肿瘤免疫[5]。

越来越多的研究表明，长非编码核糖核酸(long non-coding RNA，LncRNA)作为一类新的重要的细胞生物学行为调控因子，在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要的作用[2]。LncRNA是基因组中非蛋白质编码区的一大类转录物，长度超过200个核苷酸。最近的研究表明，LncRNA调节许多重要的癌症病理过程，如肿瘤发生、增殖、转移和耐药性[6-8]。LncRNA主要通过与关键调节蛋白相互作用来调节其功能或表达[8]。本文将Chidamide作用于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞，研究相关LncRNA在Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达情况，探讨相关LncRNA在Chidamide抑制乳腺癌细胞生长中的调控机制，为进一步明确LncRNA与蛋白在乳腺癌细胞中的分子作用机制，提供相应的理论基础和实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞(ATCC细胞库)；RPMI 1640培养基(A4192301)、胎牛血清(A3160902)、青链霉素(KGY0023,Thermo Scientific)；Chidamide(Chipscreen Biosciences Ltd)；Muse Count &Viability试剂盒(13-0618,Millipore)；RNA提取试剂盒(1182866500,Roche)；Power SYBR Green PCR Master mix(4367659,Life Technologies)；一抗抗体(Abcam lnc)；ECL化学发光试剂盒(B2162617,Roche)；LncRNA ENST00000448869.1小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)购自广州锐博生物技术有限公司；细胞分析仪(德国Premego)，超微量核酸检测仪NanoDrop-2000(美国Thermo Fisher)，PCR扩增仪Mastercyler(美国Eppendorf)，实时定量PCR仪7500(美国Life Technology),电泳系统及转膜系统(美国BIO-Rad),多通道化学发光成像系统MF-Chemi BIS2.0(以色列DNR)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人乳腺癌MDA-MB-231细胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素)，置于37 ℃，5%CO2，95%湿度培养箱中培养。当细胞长至培养瓶底70%-80%时，将细胞接种至96孔板(1×107个·L-1)或6孔板(5×108个·L-1)各孔中。将已贴壁细胞更换为无血清培养基进行同步化处理后再进行下列实验。

1.2.2高通量测序筛选阳性LncRNA 将Chidamide与MDA-MB-231细胞共同培养24 h，抽提样品的总RNA后，利用去核糖体试剂盒将rRNA去除，并将RNA片段化(平均片段长度约为200 nt左右)，逆转录合成单链cDNA，再合成双链cDNA并纯化，接着末端修复并加接头引物，PCR扩增并纯化，然后再对文库进行质检，最后上机测序。之后联合生物信息学软件分析筛选阳性LncRNA分子。通过蛋白互作生物学软件推测该LncRNA分子的互作蛋白。

1.2.3MTT和细胞活力实验 将不同浓度的Chidamide(0、20、100 μmol·L-1)与MDA-MB-231细胞共同孵育24 h，经胰酶消化后收集细胞。进行MTT实验，在490 nm的微孔板读数器上测量吸光度；收集约2×105个(50 μL细胞悬液)细胞，每组细胞中加入450 μL Count &Viability reagent，混匀室温静置后应用Muse自动细胞分析仪检测细胞活力。

1.2.4LncRNA ENST00000448869.1 siRNA(1、2、3)转染 根据Lipofectamine 3000转染试剂使用说明，先将无血清培养基与适量lipofectamine 3000转染试剂混合，室温放置5 min。再将无血清培养基分别与适量的LncRNA ENST00000448869.1 siRNA1、2、3混合，室温放置5 min。然后将两种混合液移到1.5 mL离心管中混匀后静置5 min，将转染复合物分别与六孔板中的MDA-MB-231细胞混合，培养24 h后进行后续实验。LncRNA ENST00000448869.1 siRNA的靶序列为，siRNA1：5′-GCTCTCCTGATCA ATACAT-3′；siRNA2：5′-CCAAAGTCTCCCAGTCAAT-3′；siRNA3：5′-GGCTGGAACTTAACGCTGT-3′。

1.2.5RNA提取和Real-time PCR 将Chidamide与MDA-MB-231细胞共同孵育24 h，按照RNA提取试剂盒说明进行，合成第一链cDNA后应用SYBR Green方法进行Real-time PCR，以GAPDH为内参进行反应，检测mRNA水平。LncRNA ENST0000044 8869.1引物序列Forward为5′-AGGCCTCGTTCAC CTTGACG-3′，Reverse为5′-CCCTTGCCACGTCCAC TACC-3′；Nestin引物序列Forward为5′-GCTGA AGCCCTGGGGAAAGT-3′，Reverse为5′-CCAGGGGAGTGGAGTCTGGA-3′。

1.2.6Western blot检测 将Chidamide与MDA-MB-231细胞共同孵育24 h，收集细胞提取总蛋白，并用BCA法测定蛋白含量。取等量蛋白样品煮沸10 min，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜上，4 ℃封闭过夜，洗膜，然后经过一抗孵育、洗膜、二抗孵育、ECL化学发光、凝胶成像系统成像。

2 结果

2.1 LncRNA ENST00000448869.1分子的表达水平在Chidamide处理后增高如Fig 1 LncRNA差异表达火山图和热图分析结果显示，用Chidamide处理乳腺癌MDA-MB-231细胞后提取RNA，通过18 s/28 s RNA比率质控后合成cDNA。应用高通量测序发现LncRNA ENST00000448869.1丰度比对照组明显增高。在Chidamide处理乳腺癌MDA-MB-231细胞前后LncRNA ENST00000448869.1出现差异表达，Chidamide处理使ENST00000448869.1表达水平升高。结果表明，LncRNA ENST00000448869.1可能参与Chidamide作用乳腺癌细胞后细胞生长的调控。

Fig 1 The volcano map and heat map of LncRNA differential expression (MDA-MB-231Basal—MDA-MB-231CHid)The abscissa represented the change of expression multipleof LncRNA in different samples;the ordinate represented the statistical significance of the difference in gene expression,the red dot indicated that LncRNA was significantly up-regulated and the green dot indicated that LncRNA was significantly down-regulated.

Fig 2 Assay for Chidamide concentration-response effect by MTT and cell viability assay by Muse cell analyzer in MDA-MB-231 cells

2.2 LncRNA ENST00000448869.1分子与Nestin蛋白之间存在互作关系通过选取LncRNA ENST00000448869.1，可以绘制该LncRNA与其靶基因互相作用的网络图，从而为整体性地分析LncRNA在样品中发挥的功能提供参考与帮助。蛋白互作生物学软件推测LncRNA ENST00000448869.1分子与Nestin存在蛋白互作关系。因此，我们可以认为Chidamide作用乳腺癌细胞后，可能存在LncRNA ENST00000448869.1与Nestin蛋白的相互作用而影响细胞生长。

2.3 Chidamide抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长我们将0、20、100 μmol·L-1的Chidamide与乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育24 h，进行MTT检测和细胞活力实验，Fig 2结果显示，20 μmol·L-1的Chidamide作用乳腺癌细胞，在490 nm处吸光度明显降低，100 μmol·L-1的吸光度明显降低，说明Chidamide作用后降低乳腺癌细胞的细胞活力；与对照组相比，低剂量(20 μmol·L-1)的Chidamide对乳腺癌细胞有抑制作用；高剂量(100 μmol·L-1)的Chidamide作用MDA-MB-231后，细胞活率为57.1%，明显低于对照组细胞活率71.0%，抑制效果更明显。

2.4 Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231细胞后LncRNA ENST00000448869.1和Nestin表达都增高为了验证LncRNA的分析结果，我们应用QPCR检测了乳腺癌MDA-MB-231细胞系中ENST00000448869.1片段的表达情况。同时为了明确Chidamide诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖中LncRNA ENST00000448869.1以及Nestin的表达水平，我们测定了0、20、100 μmol·L-1的Chidamide作用乳腺癌细胞后其LncRNA ENST00000448869.1和Nestin的mRNA表达水平，Fig 3结果显示，乳腺癌MDA-MB-231细胞中LncRNA ENST0000044 8869.1含量在低剂量(20 μmol·L-1)和高剂量(100 μmol·L-1)Chidamide处理后都明显上升，而Nestin的表达也在低剂量和高剂量Chidamide处理后比对照组明显增加。该结果表明，Chidamide可以促进LncRNA ENST00000448869.1和其互作蛋白Nestin的mRNA表达水平，说明Chidamide处理乳腺癌细胞后可能存在LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之间的调控机制。具体的分子机制有待进一步探索。

Fig 3 The mRNA expression of LncRNA ENST00000448869.1 and Nestin induced by Chidamide in breast cancer cells n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs Basal.

2.5 LncRNA ENST00000448869.1 siRNA转染降低乳腺癌细胞中LncRNA ENST00000448869.1和Nestin的mRNA和蛋白水平针对LncRNA ENST00000448869.1分子序列设计3对特异siRNA片段用以静默相关LncRNA的表达，LncRNA ENST00000448869.1 siRNA转染MDA-MB-231细胞后，与Chidamide共同孵育24 h，进行细胞活力检测；Real-time PCR测定LncRNA ENST00000448869.1的mRNA表达水平；Western blot实验检测Nestin的蛋白表达水平。Fig 4结果显示：siRNA静默LncRNA ENST00000448869.1后可明显增强Chidamide对MDA-MB-231细胞的药理杀伤作用，其中siRNA3作用活细胞比率为19.1%，抑制效果最明显。Fig 5结果显示：siRNA可明显抑制LncRNA分子ENST00000448869.1 mRNA分子的表达；Western blot结果显示：siRNA转染细胞后，受Chidamide激活的Nestin的表达被明显抑制。这些结果可以说明，siRNA有效静默LncRNA ENST00000448869.1分子后，乳腺癌细胞活力比对照组和Chidamide处理组明显降低，Nestin的表达也受到抑制，表明，LncRNA ENST00000448869.1分子可以靶向调控Nestin的表达，从而增加Chidamide对乳腺癌MDA-MB-231细胞的药理作用，抑制细胞生长。

Fig 4 Muse cell analysis for LncRNA-siRNA:siRNA 1,2,3 transfected into breast cancer cells respectively and incubated with Chidamide for 24 hours (n=3)

Fig 5 Assay for LncRNA mRNA expression induced by LncRNA siRNA1,2,3 transfected into breast cancer cells respectively and Nestin expression n=3)*P<0.05 vs Basal,##P<0.01 vs Chidamide.

3 讨论

乳腺癌在全球范围内女性癌症中发病率和死亡率都很高，乳腺癌的发生不仅与遗传和内分泌因素有关，还与LncRNA、miRNAs和蛋白质表达不当有关[9-10]。HDACi是一组有前景的抗癌药物，通过改变染色质结构和基因表达，在诱导癌细胞凋亡和细胞周期停滞中具有潜在作用[11]。Chidamide作为新一代的HDACi，不会明显增加化疗的副作用[12]。我们将Chidamide与乳腺癌MDA-MB-231细胞共同孵育，利用Muse自动细胞分析仪发现，Chidamide可以降低MDA-MB-231细胞活力，抑制细胞生长。

LncRNA被认为是最敏感和特异的癌症生物标志物之一，在不同水平上参与各种癌症的发展和进展，包括表观遗传、转录和转录后调节[13]。有研究表明，LncRNA是乳腺癌发展的关键调节因子，与控制自噬有关，因此识别与自噬相关的具有乳腺癌预后价值的LncRNA是至关重要的[13]。虽然已经报道了LncRNA通过介导转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)前转移作用和调节上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)来调节肿瘤转移，并且有些LncRNA转录物参与乳腺癌的发生，但是LncRNA在乳腺癌治疗中的生物学作用还没有得到很好的研究[14]。我们通过高通量测序联合生物信息学软件分析筛选出LncRNA ENST00000448869.1分子在经Chidamide作用后表达增高，我们进一步通过实时荧光定量PCR验证了ENST00000448869.1的准确性。进一步的后续实验可以检测LncRNA ENST00000448869.1是否与细胞自噬相关。

Nestin是第VI型中间丝蛋白，实验模型和人类样本都表明Nestin在许多类型的肿瘤和一些其他的组织中的表达上调[15]。Nestin与肿瘤发生相关，因为它在癌症组织中的表达高于正常组织，尤其在小肿瘤血管和基质癌细胞中Nestin出现高表达[16]。因此Nestin可以作为乳腺癌新血管生成的重要标志物。我们通过蛋白互作分析软件的结果，说明LncRNA ENST00000448869.1分子与Nestin存在蛋白互作关系。我们通过Real-time PCR验证了在Chidamide作用乳腺癌细胞后Nestin的mRNA表达增高。为了进一步验证LncRNA ENST00000448869.1和Nestin在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的调控作用，我们设计了特异siRNA来静默相关基因的转录。我们利用siRNA抑制LncRNA ENST0000044 8869.1分子的转录后，在Chidamide作用细胞时，siRNA明显抑制了LncRNA的表达，同时在siRNA的作用下Nestin的mRNA和蛋白表达量也呈下降趋势，与此同时细胞死亡率也随之下降。这些结果说明了LncRNA ENST00000448869.1分子靶向调控Nestin的表达降低，可以抑制乳腺癌MDA-MB-231的细胞生长。

总之，我们的实验只是初步证实了在Chidamide作用乳腺癌MDA-MB-231细胞后，可能存在LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之间的调控机制抑制乳腺癌细胞生长。LncRNA ENST0000044 8869.1和Nestin之间具体的作用机制需要进一步的实验验证。本研究为进一步的探索LncRNA ENST00000448869.1在乳腺癌细胞生长作用中的机制提供了实验基础。

(致谢：衷心感谢沈阳医学院辽宁省环境污染与微生态重点实验室为本实验提供的实验设备，感谢实验室全体工作人员对本实验的大力协助。)