氟化钠暴露诱导的心肌细胞凋亡中死亡受体通路的作用

徐 薇，曹丽婷，石瑞丽，齐瑞芳，郝肖琼，马宝慧

(包头医学院生理学教研室，内蒙古 包头 014040)

氟广泛存在于日常饮用水、土壤和大气层中，绝大多数以离子的形式存在于人体，是人体所必需的微量元素之一，大多分布在骨骼及牙齿。适量的摄入氟有利于龋齿的防治，还有利于骨骼及神经系统的发育。但如果长期摄入过量的氟化物会导致慢性氟中毒，骨相损伤表现为氟斑牙和氟骨症[1]，氟也对非骨相造成损伤，如肾、肝、神经系统等[2-3]。氟的累积可对心血管系统造成损伤，导致动脉粥样硬化、心室舒张功能障碍、缺血性心脏病等[4-5]。慢性氟中毒的发病机制复杂，其造成的心血管系统损伤可能是由于氟影响了心血管系统的信号通路，使心肌细胞的结构或功能发生改变。但目前慢性氟中毒致心肌细胞损伤的具体分子机制仍不明确。

细胞凋亡是一种主动的细胞生理性的自杀行为。细胞凋亡通路包括内源性线粒体介导的通路、外源性Fas介导的死亡受体通路及内质网应激反应介导的信号通路。Fas介导的死亡受体通路可参与多种因素诱导的细胞凋亡。张佳勇等[6]在氟暴露致PC12神经细胞凋亡的研究中发现，Fas、FasL、caspase-8、FADD、caspase-3基因和蛋白表达水平明显高于对照组，但Bid基因和蛋白表达水平明显低于对照组，且呈氟暴露剂量依赖性，说明Fas介导的死亡受体通路可能参与了PC12细胞凋亡。Yuan等[7]的结果表明，Fas/FasL介导的线粒体凋亡途径在镉诱导的神经元凋亡中起重要作用。但氟暴露是否可通过Fas介导的死亡受体通路引起心肌细胞凋亡仍不明确。本研究通过体外培养H9c2心肌细胞，模拟氟染毒模型，检测不同浓度的氟化钠(sodium fluoride，NaF)对H9c2心肌细胞形态、活力及相关基因和蛋白表达的影响，以阐明氟中毒对H9c2心肌细胞凋亡的作用和可能机制，为进一步探讨慢性氟中毒致心肌细胞凋亡的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 药品与主要试剂NaF(分析纯，201702)购于天津大茂化学试剂厂；DMEM高糖培养基(Lvn1001)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，A1019)，均购于北京利维宁生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)(AR1160)，TUNEL检测试剂盒(MK1014-100)，DAB显色试剂盒(AR1025)，均购于博士德公司；TRIzol(15596018)，反转录试剂盒(K1622)，胰蛋白酶(25300054)，BCA定量试剂盒(23227)，ECL化学发光试剂(34075)，均购于美国Thermo公司；caspase-8(ab108333)、caspase-3(ab32351)及caspase-1(ab179515)，β-actin(ab8226)，均购于美国Abcam公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(P1200-1)购于索莱宝生物科技有限公司。

1.2 实验细胞系H9c2心肌细胞，购于北京协和医学院细胞资源中心国家实验细胞资源共享服务平台。

1.3 仪器CO2培养箱，细胞计数板，超速低温冷冻离心机，NanoDrop-2000微量核酸蛋白定量仪，PTC-100 PCR仪，ELX-800全自动酶标仪(美国Thermo)；7900HT实时荧光定量PCR系统(美国Applied Biosystems)；Tanon4200SF化学成像发光仪(上海天能)；小型垂直电泳槽，电泳仪电源(美国伯乐)；TE2000-U倒置相差显微镜(日本Nikon)。

1.4 方法

1.4.1细胞造模 称取4 mg NaF，溶解于50 mL含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培养基中，配制成1.92 mmol·L-1的母液，滤头过滤后，用含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培养基配制不同浓度的NaF处理液，使NaF终浓度为0.24、0.48和0.96 mmol·L-1，以不加NaF作为对照组，各组培养24、48、72 h后，收集细胞待用。

1.4.2CCK-8法检测NaF对心肌细胞活力的影响 收集对数期细胞，96孔板中每孔加入细胞悬液100 μL，培养24 h后，弃掉旧的培养基，1× PBS轻轻清洗2次，加入含有不同浓度NaF的高糖DMEM培养基，再加入CCK-8试剂(CCK-8试剂 ∶DMEM=1 ∶10)，5 % CO2、37 ℃培养箱中分别培养24、48和72 h后，使用酶标仪于设置波长450 nm下检测吸光度值。按以下公式计算细胞存活率，细胞存活率/%=[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100 %。每组5个复孔，实验重复3次。

1.4.3TUNEL法检测NaF对心肌细胞形态及凋亡的影响 收集对数期的细胞，在24孔板中放入细胞爬片，并将细胞接种于细胞爬片上，培养24 h后，加入0.24、0.48和0.96 mmol·L-1NaF，分别培养24、48和72 h，对照组不含NaF。根据说明书处理细胞后，显色。苏木精轻度复染。脱水、透明、封片。用荧光倒置显微镜观察。

1.4.4Real-time PCR法检测NaF对心肌细胞凋亡相关基因表达的影响 H9c2心肌细胞培养24、48和72 h后，收集细胞于1.5 mL的EP管中，加入1 mL TRIzol裂解细胞。按照说明书提取总RNA，并测定RNA浓度。根据反转录试剂盒说明书对提取的总RNA进行反转录，2×real-time PCR Mix说明书对反转录的cDNA进行扩增，按照2-ΔΔCt计算基因相对表达水平，以β-actin为内参，引物序列(目的基因与内参基因引物序列)见Tab 1。

Tab 1 The sequence of primers

1.4.5Western blot法检测NaF对心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响 H9c2心肌细胞培养48 h后，收集细胞于1.5 mL的EP管中，提取蛋白，并用BCA定量试剂盒进行蛋白浓度测定，计算上样量，加入4× loading buffer，10× 抗氧化剂，混匀，金属浴中100 ℃反应10 min，使蛋白变性，置于-80 ℃备用。提前制备适宜浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳后转膜，转膜结束后5 %脱脂牛奶封闭液封闭1 h，1× TBST洗涤3次后，加入一抗4 ℃孵育过夜，孵育完成后回收一抗，用1× TBST洗涤3次后，二抗室温孵育2 h后，加入发光液，显色发光，自动成像。用Tanon凝胶成像系统软件进行结果处理，以β-actin和α-tubulin为参照，用两者灰度值代表内参蛋白和目的蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 NaF对心肌细胞活力的影响采用CCK-8法检测H9c2心肌细胞活力的情况。不同浓度的NaF处理H9c2细胞0、24、48和72 h后，测定其对细胞活力的影响。从Fig 1看出，与对照组相比，NaF处理24 h后，细胞活力降低，并且随NaF浓度的增加，细胞活力也随之降低；NaF处理48、72 h后，也有相似的变化。由此可以推断，长期暴露于NaF可抑制H9c2细胞的活力，并且抑制程度与暴露时间及染毒剂量均密切相关。

Fig 1 Effect of NaF on viability of H9c2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.2 NaF对心肌细胞形态及凋亡的影响用不同浓度NaF对同一批H9c2心肌细胞处理48 h后，结果发现，对照组H9c2心肌细胞形态完整，呈长梭形或短柱形，细胞肌原纤维排列整齐，细胞间隙均匀，细胞核内几乎无颗粒；与对照组相比，随NaF染毒剂量的增加，细胞密度降低，细胞开始肿胀、变圆，细胞肌原纤维排列杂乱，细胞核内逐渐有颗粒出现；在0.96 mmol·L-1NaF处理后，细胞形态明显变得不规则，细胞明显肿胀、变圆，细胞肌原纤维无序排列，并出现大面积的横纹断裂，细胞间隙明显增大，有的贴壁细胞形状变得更加不规则，细胞核内明显有颗粒出现。随NaF浓度的增加，细胞凋亡程度明显随之增加(P<0.01)。结果表明，心肌细胞凋亡程度依赖于NaF剂量，见Fig 2。

Fig 2 Morphology and apoptosis of H9c2 cardiomyocytes after 48 hours of NaF A:control group;B:0.24 mmol·L-1 NaF;C:0.48 mmol·L-1 NaF；D:0.96 mmol·L-1 NaF，**P<0.01 vs control group

2.3 NaF致心肌细胞凋亡相关基因表达的影响NaF处理H9c2心肌细胞24 h后，与对照组相比，0.96 mmol·L-1NaF处理后心肌细胞中Fas mRNA表达量明显增加(P<0.01)；NaF处理48 h后，与对照组相比，0.48 mmol·L-1和0.96 mmol·L-1NaF处理后心肌细胞中Fas mRNA表达量明显增加(P<0.01)；NaF处理72 h后，与对照组相比，0.24、0.48和0.96 mmol·L-1NaF处理后心肌细胞中Fas mRNA表达量均明显增加(P<0.05或P<0.01)。结果可见，Fas mRNA表达量随NaF处理浓度的增加及处理时间的延长而增加，见Fig 3A。与对照组相比，随NaF浓度及处理时间的增加，caspase-1和caspase-3 mRNA表达量均逐渐增加(P<0.05或P<0.01)，见Fig 3B、C。与对照组相比，NaF处理24、48、72 h后，心肌细胞caspase-8 mRNA表达量明显增加(P<0.05或P<0.01)，见Fig 3D。

Fig 3 Effects of NaF on the mRNA expression of Fas,caspase-8,caspase-1 and caspase-3 in H9c2 cells after 24,48 and 72 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.4 NaF致心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.4.1NaF对心肌细胞Fas蛋白表达的影响 不同浓度NaF处理48 h后，与对照组相比，随NaF浓度的增加，H9c2心肌细胞Fas蛋白表达量也随之增加(P<0.05或P<0.01)，见Fig 4。

2.4.2NaF对心肌细胞caspase-8、caspase-1及caspase-3蛋白表达的影响 不同浓度NaF处理H9c2心肌细胞48 h后，与对照组相比，随NaF浓度的增加，H9c2心肌细胞caspase-8、caspase-1蛋白表达量均随之增加(P<0.05或P<0.01)；0.48和0.96 mmol·L-1NaF染毒组H9c2心肌细胞内cleaved-caspase-3蛋白表达量明显增加(P<0.01)，见Fig 5。

Fig 4 Effect of NaF on protein expression of Fas in H9c2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 5 Effects of NaF on protein expression of caspase-8,caspase-1 and cleaved-caspase-3 in H9c2 cells after 48 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

3 讨论

氟的化学性质活泼，是人体常见微量元素之一。

在慢性氟中毒非骨相损伤的研究中发现，氟易与血液中的微量元素钙、镁等相结合，使钙磷代谢平衡紊乱，抑制脱氢辅酶Ⅰ、Ⅱ系统的活性，从而引起一系列的心血管系统疾病[4]，导致严重的心功能障碍，如心输出量降低、出现心律失常和动脉粥样硬化等[5,8]。研究发现，慢性氟中毒可引起心脏组织的炎症，对心肌纤维有明显损伤[9]。Cicek等[10]研究发现，氟中毒会导致心肌代谢、功能和结构均发生一定程度的损伤。本研究结果也显示，对照组心肌细胞形态规则，呈长梭形或短柱形，肌原纤维排列整齐，细胞间隙均匀；随NaF染毒剂量的增加，细胞形态明显变得不规则，逐渐肿胀、变圆，肌原纤维无序排列，细胞间隙也随之增大，并且随着NaF染毒剂量及染毒时间的增加，细胞活力降低，这说明暴露于高浓度NaF可明显损伤心肌细胞，抑制心肌细胞生长。

然而，目前氟中毒对心肌细胞损伤的机制仍不十分明确。大量研究结果表明，过量氟可诱导机体各器官组织细胞凋亡的发生。氟化钠对成骨细胞的损伤与细胞凋亡相关蛋白表达上调有关[11]，骨骼肌细胞、肾小管上皮细胞的损伤也与细胞凋亡相关蛋白的表达水平上升有关[12-13]。本研究通过TUNEL法检测发现，不同浓度NaF处理48 h后，NaF染毒组心肌细胞的细胞核内明显有颗粒出现，即出现了细胞凋亡，且随着NaF浓度的增加，细胞凋亡明显增加，表明氟染毒呈剂量依赖性诱导心肌细胞凋亡，引起细胞损伤。这与Yan等[14]的结果一致。

死亡受体通路是细胞外的信号因子与细胞膜表面的相关受体结合，通过一系列凋亡信号的传导，从而导致细胞凋亡的发生。当Fas介导的死亡受体途径被激活时，Fas被FasL诱导发生三聚体化，形成连接器蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)，FADD与caspase-8的酶原相结合形成死亡信号诱导复合物(death-inducing signaling complex，DICS)，DICS可导致caspase-8被激活，激活状态的caspase-8可激活下游的caspase-3，最终导致细胞凋亡的发生。caspase-1参与了白细胞介素1β(recombinant human interleukin-1 beta，IL-1β)的活化和功能，还可减轻各种动物模型中的炎症反应，并且很可能参与了caspase-8下游的凋亡途径[15]。Fas/caspase通路参与调控缺氧复氧引起的心肌细胞凋亡[16]。本研究结果表明，随着NaF染毒浓度和染毒时间的增加，Fas、caspase-8、caspase-1和caspase-3 mRNA和蛋白表达水平也随之增加，说明在H9c2心肌细胞中，细胞凋亡相关基因的表达与其暴露在NaF中的浓度和时间有关，提示氟化钠可能通过Fas表达上调参与心肌细胞凋亡。

综上所述，NaF可诱导H9c2心肌细胞活力下降及细胞凋亡增加，且Fas、caspase-8、caspase-1和caspase-3的基因表达和蛋白表达水平随NaF染毒剂量的增加及染毒时间的延长明显上调，提示Fas介导的死亡受体通路可能参与氟诱导的心肌细胞损伤。本研究结果仅从细胞水平探讨了氟染毒对心肌细胞的凋亡机制，为地方性氟中毒的预防和治疗提供依据。在今后的研究中将从整体水平进一步明确氟化钠诱导心肌细胞凋亡与Fas通路的关系及具体机制。