白藜芦醇苷通过MAPK和Nrf2/HO-1通路减轻LPS引起的炎症反应

杨 君，沙前坤，李玉先，陈 瑾，龙 馨，颜 丽，张 华

(1.重庆市妇幼保健院宫颈疾病诊治中心,重庆 400021;2.重庆央都生物研究院药学部,重庆 408000;3.重庆医科大学北碚附属医院,重庆 400700;4.重庆市中医院药剂科，重庆 400011；5.重庆医科大学附属第一医院皮肤科,重庆 400016)

炎症是天然免疫反应的关键因素，可以减轻组织损伤。但是炎症持续时间过长，组织损伤程度会加重[1-2]。研究表明LPS是革兰氏阴性菌外膜内毒素的致病成分，能够激活多种信号通路，如免疫和炎症反应的紊乱等[3]。白藜芦醇苷(piceid，PD)是从传统中药虎杖中提取的单体化合物，近年来研究发现，PD具有多种重要的生物学功能，如抗氧化、抗血栓形成等。以PD作为主要活性成分的虎黄烧伤搽剂(生产厂家：重庆喜旋生物科技有限公司，规格：50 mL/瓶，批准文号：国药准字Z20010151)能够促进创面愈合，调控机体免疫能力。然而其在抗炎作用中的研究机制尚未阐明。本研究旨在探究PD在LPS引起的炎症反应中的影响及分子机制，为揭示PD的治疗机制以及其在临床用药中的运用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料PD(批号:09042022)购自美国LKT实验室，用二甲基亚砜(DMSO)(购自国药集团化学试剂有限公司)溶解配制成10 mmol·L-1的贮存液储藏于-20 ℃冰箱。抗体Anti-JNK1/2兔抗人单克隆抗体、Anti-ERK1/2鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司，Anti-p38MAPK、Anti-p-JNK1/2、Anti-p-ERK1/2和Anti-p-p38MAPK兔抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。ELISA试剂盒购自Abcam公司；RPMI 1640培养液、DMEM培养液和胎牛血清均购自美国Gibco公司，BCA蛋白定量检测试剂盒购自Bio-Rad公司，细胞裂解液RIPA购自碧云天生物技术有限公司。羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均购自美国Santa Cruz公司，引物序列由上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 RAW264.7(小鼠巨噬细胞)细胞系来自中国科学院细胞库。细胞系在DMEM高糖正常培养基(包括10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素)在加湿5% CO237 ℃培养箱中培养。

1.2.2MTT 采用MTT法测定细胞活力。将1×105RAW264.7细胞接种于96孔板中，培养过夜，然后用PD(0、1.0、3.0、5.0 μmol·L-1)处理48 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)，培养3 h。然后去除培养基，用DMSO(100 μL/孔)溶解结晶紫，最后用酶标仪在570 nm处测定。

1.2.3Western blot 将RAW264.7细胞接种，过夜培养。LPS(1 mg·L-1)诱导2 h，在指示时间点PD(20、40、80 μmol·L-1)进行预处理。用RIPA (1% PMSF和1% DTT)提取总细胞蛋白，提取细胞质和核蛋白。采用BCA蛋白试剂盒测定蛋白质浓度，变性蛋白用SDS-PAGE凝胶分离并转移到PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h，PVDF膜与一抗(1 ∶1 000)4 ℃过夜孵育。之后用TBST洗涤，并与二抗(1 ∶5 000)在室温下孵育2 h。利用Bio-Rad发光试剂盒与Chemi DocTMMP成像系统采集图像。

1.2.4 流式细胞仪检测密度为1.5×105RAW264.7细胞接种于24孔板过夜。用PD预处理细胞1 h，然后用LPS(1 mg·L-1)处理2 h。用不同的探针检测相应的指标，包括NO检测器DAF-FM (5 μmol·L-1，1 h)，ROS检测器DCFH2-DA(10 μmol·L-1，30 min)，Ca2+检测器Fluo-3/AM(1 μmol·L-1，1 h)或MMP 检测器JC-1(10 mg·g-1，30 min)。探针孵育后，用流式细胞仪(BD，美国)采集细胞并进行检测。

1.2.5免疫荧光染色 RAW264.7细胞以1.5×108个·L-1的密度接种到共聚焦培养皿中过夜，用PD预处理4 h，并用LPS刺激(1 mg·L-1)预处理2 h。固定、打孔、封闭后，将培养皿中的细胞与抗体在4 ℃下孵育过夜。最后将细胞与Alexa Fluor 594二抗孵育1 h。Hoechst 33342染色显示细胞核。在共聚焦显微镜系统(Leica，Wetzlar，德国)下收集荧光图像。

1.2.6ELISA 按照说明书准备所有试剂，工作标准液和样品。将50 μL所有样品或标准液加到适当的孔中。在每个孔中加入50 μL抗体混合物。密封板并在设置为400 r·min-1的振荡器上于室温孵育1 h。用350 μL 1×Wash buffer PT清洗3次。晾干以除去多余的液体。每孔中加入100 μL TMB显影液，并在避光中在设置为400 r·min-1的平板振荡器上孵育10 min。每孔中加入100 μL终止溶液。在平板振荡器上将平板摇晃1 min以进行混合记录450 nm处的OD。

1.2.7荧光测定 RAW264.7细胞以4×108个·L-1的密度过夜接种于96孔板中。用PD预处理细胞1次，然后在有或没有LPS的情况下再孵育2 h。用JC-1(10 mg·L-1)和DCFH2-DA(100 μmol·L-1)染色30 min。最后通过荧光显微镜捕获荧光图像。

2 结果

2.1 PD减少LPS引起的炎症反应利用MTT试验,计算不同浓度的PD(1.0、3.0、5.0 和7.0 μmol·L-1)处理后的细胞生存率，结果提示不同浓度的PD处理细胞48 h后，细胞的存活率分别为(98.56%、96.51%、96.56%、87.24%)。因此，在后续实验中将选用浓度1.0-5.0 μmol·L-1。

利用流式细胞术检测PD对于上述指标的影响，发现PD预处理呈剂量依赖性的方式抑制LPS刺激的亚硝酸盐水平和iNOS蛋白的表达。如Fig 1所示，LPS处理的细胞亚硝酸盐水平急剧升高。流式细胞术检测表明，PD可以减少细胞NO生成。COX-2蛋白的表达无影响。

Fig 1 PD reduced LPS-induced inflammatory A:PD cytotoxicity in RAW264.7 cells;B:PD reduced the inflammatory response;C:Effect of PD on the expression of COX-2 and iNOS;D:Flow cytometry detection and analysis.*P<0.05 vs LPS group

2.2 PD减少LPS诱导的促炎细胞因子的表达利用ELISA检测PD处理后相关因子的水平，结果显示，LPS诱导促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生(Fig 2)。同时，用PD预处理可明显抑制LPS处理后TNF-α和IL-6的产生。

Fig 2 PD reduced expression of LPS-induced pro-inflammatory A、B：ELISA of TNF-α and IL-6 levels;C：Flow cytometry analysis of Fluo-3/AM labeled cells.*P<0.05 vs LPS group

2.3 PD对于MAPK和Nrf2/HO-1通路的影响利用蛋白印记方法检测MAPK和Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达，如Fig 3所示，PD明显抑制 p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-p38MAPK的蛋白水平，但对JNK1/2、ERK1/2和p38MAPK总量的表达无影响。

Fig 3 Effect of PD on MAPK and Nrf2/HO-1 *P<0.05 vs LPS group

2.4 PD抑制活性氧的生产和降低线粒体膜电位利用DCFH2-DA检测ROS的产生，结果表明，PD明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞ROS生成(Fig 4A)。

Fig 4 PD inhibited production of reactive oxygen species and reduced mitochondrial membrane A、B、C：Immunofluorescence and intracellular ROS kit to detect intracellular ROS production;D：JC-1 probe to detect cell mitochondrial membrane potential (MMP).*P<0.05 vs LPS group.

另外还采用免疫荧光法和细胞内ROS试剂盒检测细胞内ROS的产生。结果表明，PD降低了细胞内ROS水平(Fig 4B、C)。LPS破坏线粒体膜电位(MMP)的稳定性，不利于维持细胞正常的生理功能。本研究利用免疫荧光染色发现通过LPS刺激(绿色染色)增加JC-1单体，但PD的预处理降低了JC-1单体，使其恢复为聚集体(红色荧光)(Fig 4D)。

2.5 PD对Keap1-Nrf2信号通路的影响研究表明，LPS可激活巨噬细胞中的Nrf2信号通路。在本研究检测PD对Keap1-Nrf2信号通路的影响。如Fig 5所示，LPS刺激可诱导Keap1表达上调，而PD预处理则Keap1蛋白表达略有下调。用PD预处理可增加RWA264.7细胞中Nrf2和HO-1蛋白的表达。与NC和LPS刺激组相比，PD的预处理提高了细胞核中Nrf2蛋白水平，但降低了细胞质中的蛋白水平。

Fig 5 Effect of PD on Keap1-Nrf2 signaling A:Keap1,Nrf2y and HO-1 level detection;B:Nuclear and cytoplasmic Nrf2 level detection;C:Quantitative analysis of differences in Keap1,Nrf2y and HO-1 level of each group).*P<0.05 vs LPS group

2.6 Toll样受体参与PD的抗炎过程在多个细胞上特异性发现的TLR4在炎症过程中起着重要的作用。在LPS和MD2存在下，TLR4二聚，调节NF-κB、MAPK和其他信号级联，通过促炎细胞因子释放诱导病原体特异性天然免疫反应。为了评价TLR4是否参与PD的抗炎过程，采用蛋白印迹检测不同浓度PD处理后TLR4的表达情况。我们的结果表明，PD减弱了LPS诱导的TLR4的表达(Fig 6)。

Fig 6 Toll-like receptors involved in anti-inflammatory *P<0.05 vs LPS group

3 讨论

炎症反应是生命中常见的病理反应，存在于各种组织和器官中[1]。炎症与许多疾病的发生和发展过程有关，包括中风、关节炎、神经退行性疾病和心血管疾病等[2]。因此，抑制炎症在炎症相关疾病治疗中起关键作用。PD具有多种重要的生物学功能，如抗氧化、抗血栓形成等，然而其抗炎作用的研究还相对较少。基于传统中药研究的经验，PD的药用价值使其被添加到越来越多的成药中。具有代表性的成药虎黄烧伤搽剂，以PD为主要活性成分，其治疗烧伤效果显著，主要的适应症为严重烧伤引起的休克和细菌感染等。本文旨在进一步探索PD抗炎作用的分子机制，为拓展其临床应用打下理论基础。

本研究采用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，发现PD减少LPS引起的炎症反应，并减少LPS诱导的促炎细胞因子的表达。而且大量证据表明与TLR4结合的LPS可以激活许多炎症途径，如MAPKs途径[2-6]。据报道TLR4和MAPKs信号通路参与炎症反应[6]。在LPS诱导的RAW264.7细胞中增强JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化[7]。本研究显示PD明显抑制了JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化，而没有改变总JNK1/2、p38、ERK1/2蛋白质水平的激活。此外，我们的结果表明TLR4参与PD的抗炎过程。综上所述，PD通过介导NF-κB和MAPKs途径表现出抗炎作用。

文献报道ROS的产生介导了各种炎症信号通路，从而促进了炎症反应[8]。MMP以及ROS45也是重要的炎症反应信号。因此抑制ROS或促进MMP可能也是炎性疾病最重要的治疗靶点[9]。本研究发现，PD明显降低了ROS的产生并恢复了线粒体膜电位，从而减轻了炎症反应。

越来越多的证据表明，HO-1是一种抗氧化酶，在血红素降解中起着至关重要的作用，是氧化应激和炎症细胞病理生理条件的重要机制[8]。本研究结果表明，用PD预处理可降低Keap1表达，促进Nrf2核易位并在体外诱导HO-1。更有文献报道Nrf2作为调节HO-1表达的主要蛋白，通常与Keap1一起分布在细胞质中。但是，当Keap1在氧化应激下降解时，Nrf2释放并迁移到细胞核，然后诱导HO-1表达[9-11]。

LPS诱导其下游通路的活化可导致细胞分泌大量的炎症因子，同时使iNOS和NO表达增加。然而MAPKs在LPS诱导的细胞反应中起重要作用，研究发现LPS能够诱导激活MAPK通路。此外HO-1对于降低促炎COX-2和iNOS水平至关重要，这有助于减少COX-2衍生的PGE2和iNOS衍生的NO的产生[12]。HO-1是由Nrf2介导的，通过调节抗氧化反应，Nrf2在改善细胞氧化应激和炎症损伤方面起着至关重要的作用。在正常情况下，Nrf2位于细胞质中，其抑制蛋白是Keap1[13-14]。在应激条件下，Nrf2与Keap1解离，转运到细胞核中，与抗氧化反应元件结合，从而诱导Ⅱ期解毒酶和细胞保护基因，如HO-1[11,15-17]。综上，PD可能通过MAPK和Nrf2/HO-1通路对RAW264.7细胞表现出抗炎和抗氧化作用。因此，PD可以作为研究和开发炎性疾病的潜在药物。