超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中5种硝基咪唑残留量

2021-12-15薛庆海

粮食与食品工业 2021年6期

薛庆海

无锡市食品安全检验检测中心 (无锡 214028)

硝基咪唑类药物(nitroimidazoles，NMZs)是一类具有硝基咪唑环结构的化合物，被广泛用于治疗动物的厌氧细菌和寄生虫感染，同时也是一种生长促进剂，能够促进禽畜的生长及改善饲料转换率[1,2]。研究表明该类化合物具有潜在的细胞诱变性、致畸致癌性等危害，且在体内转化的代谢产物仍具有毒理作用[3-5]，因此已被美国和欧盟等发达国家禁用。我国也对硝基咪唑类兽药进行了严格限制，GB 31650—2019[6]仅允许甲硝唑、地美硝唑作为治疗用，但不得在动物性食品中检出。

目前，硝基咪唑类药物的检测方法有酶联免疫吸附法[7]、液相色谱法[8,9]、气相色谱-串联质谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[2-4,11-14]。酶联免疫吸附法检测成本较低，适用于批量快速筛查，但容易出现假阳性、假阴性；液相色谱法的灵敏度较低，容易被杂质干扰，无法准确定性；气相色谱-串联质谱法，样品前处理需要衍生化，所需时间长，操作较复杂；液相色谱-串联质谱法的灵敏度高、选择性好，目前在硝基咪唑类的检测中广泛应用，相关国家标准[15-17]也采用了液相色谱-串联质谱法。GB/T 21318—2007、SN/T 1928—2007标准前处理步骤较多，而且用到GPC净化，试剂消耗多且不能批量前处理；SN/T 2624—2010标准不仅适用于硝基咪唑类的检测，还适用于磺胺类、三苯甲烷类等多种碱性药物残留的检测，所以前处理相对复杂。本研究建立了一种QuEChERS提取净化、C18固相萃取柱进一步净化，UPLC- MS/MS法检测猪肉中5种硝基咪唑残留量的方法。该方法前处理简单、回收率高、精密度高，可用于猪肉中5种硝基咪唑残留量的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉样品，购于无锡市各超市；甲硝唑(Metronidazole，MNZ)、洛硝哒唑(Ronidazole，RNZ)、地美硝唑(Dimetridazole，DMZ)、羟基甲硝唑(MNZOH)、羟甲基甲硝咪唑(HMMNI)标准品(纯度大于99.5%)，德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸，色谱纯，德国默克公司；微孔滤膜(有机系)，0.22 μm，上海安谱；QuEChERS萃取盐包(含4 g无水硫酸钠、1 g氯化钠)，美国安捷伦公司、C18固相萃取柱(1.0 g，6 mL)，美国安捷伦公司。

1.2 仪器与设备

QTRAP 4500型超高效液相-串联四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)，美国SCIEX公司；C18色谱柱，美国安捷伦公司；Vortex 3型涡旋振荡器，德国IKA公司；Milli-Q IQ7000型超纯水系统，德国默克公司；超声波清洗机，宁波新芝公司；X1R型高速冷冻离心机，美国赛默飞公司；固相萃取装置，上海安谱公司；AutoEVA-20Pus型氮吹仪，厦门睿科公司；ME204E型分析天平，瑞士梅特勒公司；XS205DU型分析天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 实验方法

1.3.1溶液配制

0.1%甲酸水溶液：吸取1.0 mL甲酸，加超纯水混匀并定容至1 000 mL。

标准溶液配制：准确称取10 mg(精确至0.1 mg) 每种标准物质，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，标准储备液的浓度为1 mg/mL，贮存于棕色标液瓶中，-20 ℃冰箱中保存。分别吸取每种标准储备液1.0 mL，用甲醇稀释并定容至100 mL，得到10 μg/mL的混合标准中间溶液，贮存于棕色标液瓶中，0 ℃～4 ℃冰箱中保存。使用时根据需要用空白基质溶液稀释成适当浓度的空白基质混合标准溶液，现用现配。

1.3.2样品前处理

称取5.0 g(精确至0.01g)经搅碎、混匀的样品至50 mL离心管中，加入3 mL水，涡旋混匀，加入10 mL乙腈和QuEChERS萃取盐包，涡旋振荡10 min；在4 ℃下以10 000 r/min的转速下低温离心10 min，转移上清液至另一离心管中，待进一步净化；将上清液全部倾入用5 mL甲醇预淋洗过的C18固相萃取柱中，以1 mL/min的速度收集流出液，再用10 mL甲醇进行洗脱，收集全部洗脱液于试管中，用氮吹仪在40 ℃条件下吹至近干，残渣用初始流动相溶解并定容至1 mL，经0.22 μm有机相滤膜过滤，待测。

1.3.3.1 超高效液相色谱条件

色谱柱，Agilent ZORBAX XDB-C18(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；柱温30 ℃；流动相，A为0.1%甲酸水，B为甲醇；流速0.3 mL/min；进样量2 μL。

梯度洗脱程序：0～1 min，5%B；1～3 min，5%～95%B；3～4 min，95%B；4～4.2 min，95%～5%B；4.2～6 min，5%B。

1.3.3.2 质谱条件

离子源，电喷雾离子源(ESI)；扫描方式，正离子扫描；电喷雾电压5 500 V；雾化气压力50 psi；气帘气压力35 psi；辅助气压力35 psi；离子源温度550 ℃；碰撞气为氮气；检测方式，多反应监测(MRM)。其他参数见表1。

表1 5种硝基咪唑的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

考虑到乙腈对大多数兽药残留的提取效果较好、通过盐析较容易实现与水相的分离[18]，因此选用乙腈作为硝基咪唑类药物的提取剂。猪肉样品(加标1.0 μg/kg)中的硝基咪唑类药物经过乙腈提取，QuEChERS萃取盐包净化后，经过UPLC-MSMS分析，发现基质干扰比较大，考虑使用固相萃取柱进一步净化。选用了C18、MCX、SCX 3种固相萃取柱对QuEChERS提取液净化，发现净化后，硝基咪唑类药物的回收率均在85%以上，回收效果良好。考虑到使用C18固相萃取柱净化只需要用到甲醇一种溶剂，而MCX、SCX柱则要使用多种溶液，所以选用C18柱进行净化。

2.2 定溶液的优化

在实验中发现，采用甲醇直接定容进样，多个化合物产生溶剂效应，色谱峰宽大畸形，甚至分叉；而采用初始流动相0.1%甲酸-甲醇(95∶5，v/v)定容时，可获得尖锐对称的色谱峰，并且化合物灵敏度较高。所以，选择初始流动相0.1%甲酸-甲醇(95∶5，v/v)定容。

2.3 质谱条件的优化

将5种硝基咪唑类混合标准中间溶液用空白基质溶液稀释成1 μg/mL的空白基质标准混合溶液，使用针泵进样，直接进质谱。在正离子模式下进行一级质谱全扫描，确定各硝基咪唑类的分子离子，将分子离子作为母离子；给予一定的碰撞能量对母离子进行二级质谱扫描，进一步对碰撞能量和去簇电压等参数进行优化，选取响应高且干扰小的两个子离子作为定量定性离子，响应最高的作为定量离子，优化结果见表1。

2.4 线性范围、回归方程和定量限

在选定的液相色谱-串联质谱条件下，5种硝基咪唑类药物出峰良好，其典型的MRM谱图见图1。

图1 5种硝基咪唑标准溶液的典型MRM图

称取6份空白样品，按照1.3.2的前处理方法处理，得到空白基质溶液，配制浓度为1、10、50、100、200、500 μg/L的空白基质混合标准溶液，分别进行测定。以待测物定量离子的峰面积y对其浓度x(μg/L)得到5种硝基咪唑的线性回归方程，其线性方程及相关系数见表2。以信噪比为10(S/N=10)计算5种硝基咪唑的定量限，见表2。

表2 5种硝基咪唑的回归方程、线性范围、相关系数、定量限

2.5 方法回收率和精密度

MNZOH在0.6、1.2、6.0 μg/kg 3个水平，其余4种硝基咪唑分别在0.5、1.0、5.0 μg/kg 3个水平进行加标回收实验，每个水平设置6个平行样，并计算其加标回收率，结果如表2所示。结果表明：在猪肉样品中，5种硝基咪唑的平均加标回收率在79.6%～103.2%之间，各平行样间的相对标准偏差在2.1%～9.1%之间，平行性较好。