精氨酸高效利用乳酸菌的筛选及应用

蔡国林，周佳慧，樊 振，赵燕慧，周孝东，孙海彦，龙 杰

1.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(无锡 214122)2.新疆天康饲料有限公司 (五家渠 831300)3.江苏艾生牧饲料有限公司 (盐城 224343)4.中国热带农业科学院热带生物技术研究所 (海口 571101)5.广州誉衡生物科技有限公司 (广州 510670)

乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是指一群可发酵碳水化合物、产生大量乳酸的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称。乳酸菌不仅拥有独特的氨基酸代谢系统，能够特异性吸收某些氨基酸，而且其产生的乳酸、乙酸等有机酸以及各种小肽、游离氨基酸还能改善饲料风味。乳酸菌成为国内固态发酵饲料开发的重要益生菌资源[1]。花生粕作为一种潜在的优质蛋白饲料，精氨酸与赖氨酸比例失衡问题限制了其在动物养殖中的应用，过量的精氨酸是造成其产生氨基酸拮抗作用的主要因素，降低精氨酸含量、提高赖氨酸含量成了解除花生粕应用限制的关键因素。

目前，针对花生粕赖氨酸、蛋氨酸含量不足的问题，人们提出了相应的解决办法，向饲料中额外添加赖氨酸或蛋氨酸，以保证饲料中精氨酸与赖氨酸比例达到平衡。赖氨酸盐酸盐进入动物体内，多为游离的状态，大量游离赖氨酸的摄入会使得动物对该物质吸收过快，造成氨基酸之间新的不平衡，不仅引起其他氨基酸吸收率下降，而且产生负氮平衡，使动物出现营养不良、代谢功能衰退等症状[2]。因此，仅通过向花生粕饲料中添加赖氨酸盐酸盐或硫酸盐并不能从根本解决氨基酸不平衡问题，甚至可能会对畜禽的生长产生严重的副作用[3]。此外，蔡国林采用卡式酵母JD-15和马克斯克鲁维酵母JD-16发酵花生粕，明显提高了赖氨酸和蛋氨酸的产量，但精氨酸含量无显著改变[4]；任晓静利用LactobacilluscaseiR-07结合酶制剂固态发酵花生粕，发现赖氨酸含量由1.51%提高至1.76%，在一定程度上改善花生粕中氨基酸不平衡的问题，但精氨酸与赖氨酸比例仍超过3∶1[5]，这可能与所采用的乳酸菌不能高效利用精氨酸有关。 因此，通过筛选既能吸收利用精氨酸又不产生生物胺的乳酸菌来发酵精氨酸含量过多的花生粕，不仅可以解决精氨酸与赖氨酸等其他氨基酸比例不平衡的问题，而且避免大量瓜氨酸作为有机氮源流失、以及被作为前体物质生成有毒的生物胺的问题，促进微生物对于有机氮源的再利用，进而提高花生粕的饲用品质。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1培养基的制备

(1)MRS培养基：参考禹伟论文中培养基配置方法[6]。

(2)MRS-CaCO3培养基：在MRS培养基中添加2.0 g/L的CaCO3，115 ℃灭菌20 min[7]。

(3)改良生物胺培养基：参考文献[8]。

(4)MRS-Arg培养基：在MRS培养基中添加5 g/L精氨酸，115 ℃灭菌20 min。

(5)改良MRS-Arg培养基：MRS-Arg培养基中胰蛋白胨和牛肉膏添加量减半。

(6)改良液体脱羧培养基：参考文献[9]。

1.2 实验方法

1.2.1能利用精氨酸的乳酸菌的初筛

取1.0 g花生粕原料置于3 mL MRS液体培养基37 ℃静置培养3 d，转移至30 mL MRS液体培养基继续培养2 d，吸取培养液1 mL，用无菌生理盐水依次稀释10-3、10-4、10-5、10-6倍，每个稀释度取100 μL与MRS-CaCO3固体培养基混合倒平板，37 ℃培养48 h，观察培养基菌落生长，挑取有明显溶钙圈的单菌落，于MRS固体培养基划线纯化，再挑取单菌种于MRS液体培养基静置培养24 h，甘油管保藏。取浸米水、黄酒发酵液、泡菜发酵液、东北酸菜发酵液，按照上述相同步骤处理，甘油管保藏菌株[7]。

取甘油保藏菌株按2%的接种量接入1 mL MRS液体培养基，培养24 h后转接于3 mL MRS培养基，待其OD600达到0.8～1.0时，按2%接种量接种到1 mL的改良MRS-Arg液体培养基，37 ℃静置培养18 h，涡旋震荡，取200 μL菌液于96空板，测定OD600的值，比较菌体生长浓度，筛选生长能力强的菌株。

1.2.2能利用精氨酸且不产生物胺的乳酸菌的初筛

选择生长能力强的菌株，按照2%的接种量接种于1 mL的MRS液体培养基，37 ℃静置培养，待其OD600达到0.8～1.0时，按1%接种量接种于改良生物胺培养基，30 ℃静置培养3 d，10 000 × g、4 ℃离心5 min，取上清200 μL于96孔板，在每个孔中加入50 μL 1.0 g/L的溴甲酚紫指示剂反应10 min，原始培养基作对照。根据菌株利用精氨酸经ADI途径代谢产生氨以及微生物通过氨基酸脱羧酶作用于氨基酸脱羧而生成生物胺引起培养基pH变化导致培养基颜色变紫的原理，初步筛选出既能吸收利用精氨酸又不产生氨和生物胺的乳酸菌[8]。

1.2.3能利用花生粕精氨酸的乳酸菌的确定

取初步筛选的保藏菌，按照2%的接种量接种于1 mL的MRS液体培养基，37 ℃静置培养，待其OD600达到0.8～1.0时，按1%接种量接种于MRS-Arg培养基，30 ℃静置培养3 d，取1 mL菌液，10 000 × g、4 ℃离心5 min，取上清500 μL与5%(w/v)TCA按照等体积混合，4 ℃过夜沉淀蛋白，10 000 × g、4 ℃离心10 min，取上清10 μL与100 μL OPA混合衍生，于HPLC测定精氨酸含量，每个菌株作两个平行，结果表示为平均值±标准偏差[10]。

对筛选出的高精氨酸利用菌株进行生物胺产生能力测定。样品衍生化处理及色谱条件的选择参照王然然的论文[9]。

1.2.4能利用花生粕精氨酸的乳酸菌的鉴定

利用细菌DNA抽提试剂盒对所选乳酸菌的DNA进行提取，提取的细菌 DNA进行PCR，PCR扩增后的序列，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测得的基因序列在NCBI上进行Blast 比对分析，并建立系统发育树。

1.2.5短乳杆菌Z-73在花生粕发酵上的初步应用

(1)在未预消化处理花生粕上的应用

取40.0 g花生粕和200 mL蒸馏水，混合均匀，调节pH 5.5，转移至500 mL锥形瓶，121 ℃灭菌20 min，冷却后接种二级活化的乳酸菌(1.0 × 109CFU/mL)，接种量5%，发酵48 h，发酵结束后冷冻干燥并粉碎得到发酵花生粕。

(2)在预消化处理花生粕上的应用

取40.0 g花生粕和200 mL蒸馏水，混合均匀，95 ℃预处理20 min后，降温至50 ℃，分别加入纤维素酶100 U/g和10 U/g(以花生粕重量计)，50 ℃酶解1 h，接着添加酸性蛋白酶1 500 U/g酶解4 h，再添加风味蛋白酶5 000 U/g酶解1 h，最后添加胰蛋白酶250 U/g，40 ℃酶解1 h，酶解结束后接种二级活化的乳酸菌(1.0 × 109CFU/mL)，接种量5%，发酵48 h，发酵结束后冷冻干燥并粉碎得到酶解发酵花生粕。

以花生粕作为对照，对发酵花生粕和酶解发酵花生粕进行游离精氨酸和水解精氨酸含量的测定，考察短乳杆菌Z-73在花生粕氨基酸平衡上的初步应用。

2 结果与讨论

2.1 能利用精氨酸的乳酸菌的初筛

从花生粕、浸米水、黄酒发酵液、泡菜发酵液、东北酸菜中共筛选出151株具有较大溶钙圈的菌株，初步判定为乳酸菌。将这151株乳酸菌接入MRS-Arg培养基，对这些菌株进行精氨酸耐受性实验，考察它们在高精氨酸环境下的生长能力，这些菌株的生长能力频数分布如图1所示。由图1可知，OD600值超过0.9的菌株有79株，初步判定这些菌株具有较好的精氨酸利用能力。

图1 MRS-Arg培养基中菌株的生长能力频数分布图

2.2 能利用精氨酸且不产生物胺乳酸菌的初筛

根据添加溴甲酚紫对改良生物胺培养基会产生颜色变化的原理，对上述79株乳酸菌进一步筛选，以原始培养基作为对照，添加有溴甲酚紫的原始培养基颜色呈现淡绿色，可能是因为原始培养基pH处于5.2～6.8之间，因而呈现出中间过渡阶段的绿色。从图2可以看出，有13株乳酸菌呈现淡紫色，可能是因为菌株吸收了培养液中的碱性物质精氨酸，且产生少量生物胺或NH3[11]，溶液呈现弱碱性，溴甲酚紫变淡紫色。剩余的66株乳酸菌呈现深紫色，可能是因为这些菌株虽然能吸收精氨酸，但会产生的大量生物胺或NH3，使溶液pH偏向于6.8，故溴甲酚紫完全变色。根据上述分析原理，选择指示剂颜色为淡紫色的13株菌株，初步判定为既能利用精氨酸又不产生生物胺的目标菌株，分别为菌株Z-2，Z-3，Z-5，Z-11，Z-49，Z-50，Z-59，Z-67、Z-69、Z-71、Z-73、Z-77、Z-79。

图2 利用精氨酸且不产生生物胺菌株的初筛

2.3 能利用花生粕精氨酸的乳酸菌的确定

微生物普遍具有氨基酸脱羧酶基因，能够使氨基酸脱羧后转变为生物胺，多数乳酸菌具有ADI途径，但是降解精氨酸的能力有所差异，其产生瓜氨酸和鸟氨酸的能力也有所不同，因而最终合成的生物胺的类型和含量就各不相同[6]，利用添加了溴甲酚紫的氨基酸培养基来检测生物胺的形成仅能初步筛选出具有精氨酸降解能力且不产生生物胺的菌株[12]。因此，需要通过高效液相色谱进一步测定13株菌吸收利用精氨酸及产生生物胺的能力，如表1所示，除了乳酸菌Z-59，其他12株乳酸菌的精氨酸利用率均超过95%，其中Z-3、Z-5、Z-73的利用率最高达到100%，而与菌株Z-3、Z-5相比，Z-73的生物胺生成量最低为未检出，因此，选择菌株Z-73作为后续实验发酵菌株。

表1 不同菌株的精氨酸利用率及生物胺生成量

2.4 乳酸菌Z-73的鉴定

利用细菌通用引物27F和1492R对目标菌株Z-73进行扩增得到1.8 kb左右片段，测序后片段经过NCBI的Blast比对，发现菌株Z-73与短乳杆菌2633序列一致性最高，为100%，将其命名为：LactobacillusbrevisZ-73。通过MEGA6.0构建菌株Z-73的系统发育树，结果见图3。菌株Z-73与Lactobacillusbrevis2633(MT611655.1)的同源性最高，Lactobacillusbrevis2633(MT611655.1)未见降解精氨酸的详细报道。

图3 菌株Z-73的系统进化树

2.5 短乳杆菌Z-73在花生粕发酵上的初步应用

利用短乳杆菌Z-73对花生粕和酶解预消化的花生粕直接进行发酵，对发酵后的产物进行精氨酸含量测定，其结果如图4所示。与原始花生粕相比，经乳酸菌发酵后的花生粕总精氨酸含量有所减少，由原来的5.29%分别降低至4.99%和3.21%，而游离在发酵液中的精氨酸由原来的0.34%分别降低为0.02%和0.03%，游离精氨酸近100%被转化，但是原始花生粕和发酵花生粕的非游离精氨酸含量(非游离精氨酸含量=总精氨酸含量-游离精氨酸含量)几乎一样，这说明短乳杆菌Z-73具有高效利用游离精氨酸的能力，但对于非游离状态的精氨酸，基本不能利用，转化率极低，而通过蛋白酶酶解的方法，对花生粕进行预消化，形成足量的游离精氨酸，可以促进短乳杆菌Z-73对精氨酸的吸收和转化。

图4 乳酸菌直接发酵对花生粕精氨酸含量的影响

3 结论

有较大溶从花生粕、浸米水、黄酒发酵液、泡菜发酵液、东北酸菜中筛选出151株具钙圈的菌株，通过改良MRS-Arg液体培养基初步筛选出79株能够有效利用精氨酸的菌株，再利用添加有溴甲酚紫指示剂的改良生物胺培养基，筛选获得13株能够利用精氨酸且低产生物胺的乳酸菌。通过高效液相色谱定量分析13株乳酸菌吸收精氨酸和产生物胺的能力，发现乳酸菌Z-73的精氨酸降解率最高达到100%，生物胺产生量最低(未检出)，通过16S rDNA序列分析和系统进化树构建对该菌行鉴定，发现其与短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的相似度达到100%，将其命名为短乳杆菌Z-73(LactobacillusbrevisZ-73)。将短乳杆菌Z-73应用于花生粕发酵中，可以将游离精氨酸全部利用。