脂肪源性干细胞影响增生性瘢痕的机制研究

陈俊男　李治桦　赖琳英　周桂文　梁黎明　陈敏亮

[摘要]目的：本研究旨在观察乳糜化脂肪来源干细胞条件培养液（Chyle fat derived stromal/stem cells-conditioned medium，CFSCs-CM）对增生性瘢痕成纤维细胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HSFbs）在细胞增殖、凋亡等的影响，为乳糜化脂肪改善增生性瘢痕奠定实验基础。方法：采用酶消化法从健康人腹部抽吸脂肪中获得CFSCs，制备CFSCs-CM用于处理HSFbs，采用CCK-8法、细胞划痕实验、Annexin V-FITC凋亡检测法比较不同培养液对HSFbs细胞增殖、迁移、凋亡的影响;采用酶联免疫吸附试验、蛋白免疫印记实验检测Ⅰ型胶原蛋白（Col Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（Col Ⅲ）、核心蛋白聚糖（Decorin，DN）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的分泌水平。结果：本实验结果初步验证CFSCs-CM能够抑制HSFbs的增殖、迁移，促进凋亡。CFSCs-CM还可以抑制HSFbs分泌Col Ⅰ，Col Ⅲ及α-SMA蛋白。CFSCs-CM对HSFbs能够发挥抗纤维化作用。结论：CFSCs-CM可能通过旁分泌途径来发挥抑制HSFbs的作用。

[关键词]增生性瘢痕;纤维化;脂肪来源干细胞;机制研究;条件培养液;成纤维细胞

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2021）10-0001-05

Study on the Mechanism of Chyle Fat Derived Stem Cells Affecting Hypertrophic Scars

CHEN Jun-nan1，LI Zhi-hua1，LAI Lin-ying2，ZHOU Gui-wen2，LIANG Li-ming2，CHEN Min-liang2

[1.PLA Rocket Force Characteristic Medical Center，Beijing 100088，China;2.Department of Burn and Plastic Surgery，the Fourth Medical Centre，Chinese PLA （Peoples Liberation Army） General Hospital，Beijing 100048，China]

Abstract： Objective  The purpose of this study was to observe the effects of CFSCs-conditioned medium （CFSCs-CM） on hypertrophic scar fibroblasts （HSFbs） on cell proliferation and apoptosis. Lay an experimental foundation for the application of chyle fat to improve hypertrophic scars. Methods  Enzymatic digestion method was used to obtain CFSCs from the abdomen of healthy people. CFSCs-CM was used to treat HSFbs. CCK-8， cell scratch test， Annexin V-FITC apoptosis detection were used to compare the effects of different culture media on HSFbs cells The effects of proliferation， migration， and apoptosis. ELISA and Western Blot were used to detect the secretion level of type Ⅰ collagen （Col Ⅰ）， type Ⅲ collagen （Col Ⅲ）， decorin （DN） and α smooth muscle actin （α-SMA）. Results  The results of this experiment preliminarily verify that CFSCs-CM can inhibit the proliferation and migration of HSFbs， and can promote the apoptosis of HSFbs. In addition， CFSCs-CM can also inhibit HSFbs to secrete Col Ⅰ， Col Ⅲ and α-SMA protein. CFSCs-CM can exert anti-fibrosis effect on HSFbs. Conclusion  CFSCs-CM may inhibit HSFbs through the paracrine pathway.

Key words： hypertrophic scar; fibrosis; adipose derived stem cells（ADSCs）; mechanism research; conditioned medium; fibroblast

間充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSCs）可通过其多向分化潜能及分泌功能调节免疫反应、促进血管再生，MSCs可以分泌多种具有抗纤维化作用的细胞因子促进创面愈合并减少瘢痕的形成[1-4]，其中脂肪源性间充质干细胞更具备了促进血管内皮细胞增殖，加快血液循环建立，为瘢痕的修复提供充足的营养及氧，有效改善瘢痕重塑，让更多的研究者关注其对瘢痕的改善作用[5-6]。笔者前期开展的自体乳糜化脂肪对人增生性瘢痕组织影响的临床研究，观察发现乳糜化脂肪对瘢痕具有良好的治疗效果[7]。无独有偶，通过建立人增生性瘢痕裸鼠移植动物模型，观察乳糜化脂肪注射后瘢痕的一系列转归，亦发现瘢痕发生改善。前期实验结果初步表明，乳糜化脂肪能够显著改善瘢痕质地，再次验证Tonnard[8]、Semra[9]观点，认为乳糜化脂肪的抗瘢痕作用与乳糜化脂肪来源基质/干细胞（Chyle fat derived stromal/stem cells，CFSCs）密切相关。

上述临床、基础研究掀开了瘢痕治疗的新篇章，也让更多的研究者尝试将脂肪注射应用在瘢痕的治疗之中，并探索其机制。脂肪来源干细胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）对人增生性瘢痕来源成纤维细胞（Human hypertrophic scar fibroblast，hHSFbs）的影响及其潜在机理仍在探索中。本次实验目的：从分子层面，研究CFSCs对hHSFbs生物学行为（如细胞增殖，迁移潜能和蛋白分泌水平等）的影响，对ADSCs抗纤维化及抗瘢痕形成的具体机制进行初步验证。

1  材料和方法

1.1 CFSCs的分离与培养：取下腹部脂肪抽吸手术健康女性患者颗粒脂肪约50ml，将其通过0.5mm孔径无菌滤网过滤、收集，后经0.8mm转换装置（BD Luer-Lok connector）于两5ml注射器反复推注30次，直至脂肪呈白色乳糜状外观，过滤后即为乳糜化脂肪。分离提取CFSCs步骤均参照Zuk法。将乳糜化脂肪1：1置于0.1% Ⅰ型胶原酶中，37℃水浴振荡消化lh，加等体积10%胎牛血清终止酶消化，200目细胞筛过滤，3 000rmp离心8min，弃去上层脂肪、上清，沉淀重悬接种于培养瓶后常规培养，细胞长满80%时传代。

1.2 hHSFbs的分离与提取：组织块法培养原代细胞，置于lO%胎牛血清培养液中，37℃、5% C02培养箱中常规培养。至细胞80%融合后进行传代。上述取材均得到所有患者知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.3 CFSCs-CM的收集：对照组条件培养液（Control group conditioned medium，CG-CM）：无胎牛血清的纯DMEM/F12培养基，为空白对照组;CFSCs条件培养液（CFSCs conditioned medium，CFSCs-CM）：选生长状态良好的P3代CFSCs，接种于75cm2培养瓶，生长至80%～90%融合时，换成无血清培养液DMEM/F12 15ml，培养2d后，收集上清液（CFSCs-CM），上清液0.22μm滤膜过滤，分装后冻存于-80℃冰箱备用。

1.4 CFSCs-CM对hHSFbs的处理：选择生长状态良好的P3代hHSFbs以1×105细胞/孔接种于6孔培养皿中无血清培养，待达到生长密度及状态要求时，更换CG-CM或CFSCs-CM，每孔接种1ml，置CO2培养箱培养24h后，对两种培养液作用的细胞分别检测。

1.5 hHSFbs细胞增殖状况检测：用CCK-8染色法检测细胞增殖状况。取对数生长期的hHSFbs，以2×103细胞/孔接种于96孔培养板中，实验共两块96孔板，按分组加无血清培养基，1块更换为CG-CM培养液，1块更换为CFSCs-CM培养液，观察时间点为1d、2d、3d、4d、5d，每个时间点每组6复孔，每孔加入100μl 10% CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2h，用酶标仪测在450nm波长下的吸光度值（OD值）。

1.6 hHSFbs迁移的测定-体外细胞划痕法：将两种培养液培养的hHSFbs，按照5×105细胞/孔接种于6孔板中，共两个培养板，两组各6复孔;铺板24h后细胞单层融合达100%;用无菌200μl枪头（PipetTipFinder，Knoxville，TN，USA）在培养板底部划痕，建立细胞损伤模型，然后用PBS冲洗吸弃残留细胞及死细胞，再按组更换CG-CM或CFSCs-CM，放进37℃，5% CO2培养箱恒温孵育，在倒置显微镜下（40×）照相，分别选时间点0h、24h、48h测量，用细胞迁移距离表示细胞迁移能力（率）：细胞迁移率（%）=（Gap24h或Gap48h-Gap0h）/Gap0h×100%。

1.7 细胞凋亡的检测：用Annexin V-FITC（BD PharMingen，556547，USA）双标记法分析细胞凋亡率。两组各接种2×105 hHSFbs于6个25cm2培养瓶，各组重复3次。所得数据经FlowJo软件分析，于流式細胞仪上进行细胞凋亡情况分析。

1.8 ELISA法：CFSCs-CM、CG-CM两组的hHSFbs各于无血清培养基中培养，24h收集两组的培养上清液，进行Col Ⅰ、Col Ⅲ、DN、α-SMA的分泌水平检测，在450nm处测量吸光度OD值。

1.9 蛋白免疫印记实验（Western blot）：将细胞经各组培养液处理，消化下的细胞悬液转移至离心管中，PBS清洗数次，加消化酶消化2min，离心，弃上清液，按照试剂盒说明书进行人胶原蛋白Col Ⅰ、Col Ⅲ及α-SMA的酶联免疫试验。

1.10 统计学分析：采用SPSS 20.0统计分析软件，计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，组间差异比较采用ANOVA分析。当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 CFSCs-CM对hHSFbs增殖的影响：CCK-8染色法检测hHSFbs的增殖情况，结果显示：与空白对照组相比，CFSCs-CM处理后的hHSFbs，在1d、3d、5d收集的条件培养液细胞增殖活力显著降低（P<0.05）。说明在体外条件下，CFSCs-CM能够抑制hHSFbs的增殖能力。见图1。

2.2 CFSCs-CM减缓hHSFbs的迁移能力：自hHSFbs细胞划痕24h后，对细胞迁移情况进行拍照，其结果显示，空白对照组（77.72±1.70）%划痕区被细胞迁移而覆盖，CFSCs-CM组（67.08±3.10）%划痕区被爬满，差异有统计学意义（P<0.01）。自hHSFbs细胞划痕48h后，对照组（86.95±1.10）%区域被填充，CFSCs-CM组（79.80±3.20）%区域被覆盖。差异有统计学意义（P<0.05）。说明当采用CFSCs-CM组培养液时，细胞迁移速度明显慢于空白对照组。见图2～3。

2.3 CFSCs对hHSFbs凋亡的影响：流式细胞仪观察细胞凋亡，与空白对照组相比，CFSCs-CM组hHSFbs发生早期凋亡、晚期凋亡以及坏死细胞均明显增加。见图4。

2.4 CFSCs-CM对hHSFbs的ECM蛋白合成的影响：与空白对照组相比，CFSCs-CM处理hHSFbs 48h后，对hHSFbs合成Col Ⅰ，Col Ⅲ、DN和α-SMA有抑制作用，相关蛋白分泌水平下调，差异具有统计学意义（P<0.01）。见图5。

2.5 Western Blot检测hHSFbs细胞 Col Ⅰ蛋白表达： CFSCs-CM作用hHSFbs 48h后，hHSFbs的Col Ⅰ蛋白表达明显下调，与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图6～7。Col Ⅲ及α-SMA蛋白结果未检测出具有统计学意义的差异。

3  讨论

近年来大量研究证实自体脂肪具有明显的拮抗组织器官纤维化作用、再生作用，能够改善皮肤纹理、肤质[10-11]。2013年Tonnard等[8]制备“纳米脂肪（Nanofat）”，开创脂肪移植新技术，临床应用获得满意疗效。

现在，Nanofat被越来越广泛地应用于瘢痕和美容治疗领域[9，12-13]。据此笔者在临床上制备了类Nanofat的乳糜化浓缩物-乳糜化脂肪，前期进行乳糜化脂肪对增生性瘢痕影响的临床研究，乳糜化脂肪移植后的瘢痕质地得到明显改善。在之后的动物实验研究观察乳糜化脂肪移植后对瘢痕的一系列影响，也发现瘢痕较前有显著改善变化[14]。上述前期实验结果表明，乳糜化脂肪能够改善瘢痕质地。笔者推测，这种改善源于乳糜化脂肪来源干细胞所发挥的组织再生与重建功能。

在研究中，先分离、收集乳糜化脂肪来源干细胞条件培养液（CFSCs-CM），并将其作用于增生性瘢痕源性成纤维细胞（hHSFbs），观察CFSCs-CM对hHSFbs产生的影响。研究结果表明，CFSCs-CM能抑制hHSFbs增殖、迁移，可诱导其凋亡。这些实验数据同Li等[15]的研究结论一致，即CFSCs-CM能够抑制hHSFbs增殖、迁移等。本实验结果表明，hHSFbs在CFSCs-CM干预后，细胞表达胞外基质蛋白ColⅠ，Col Ⅲ及α-SMA明显下降，与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），这提示CFSCs-CM可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原、纤维化因子的合成。认为上述表现是通过细胞水平的旁分泌效应强化了CFSCs对hHSFbs的影响。体外实验CFSCs-CM抑制hHSFbs增殖和胶原蛋白表达，及CFSCs-CM显著下调α-SMA水平（增生性瘢痕生物活性标志物），证实CFSCs-CM能够抑制增生性瘢痕中的肌成纤维细胞转化及抗纤维化作用。

综上所述，本研究证实CFSCs-CM在体外实验中，CFSCs有针对增生性瘢痕的抗纤维化作用，是介导改善瘢痕性状及质量的关键细胞。推测可能是因为CFSCs上清液中含有较多的趋化因子和生长因子，通过旁分泌作用减少构成增生性瘢痕ECM结构胶原蛋白的合成，并促进增生性瘢痕来源成纤维细胞的凋亡，继而发挥抗瘢痕作用。这也为以后有效运用CFSCs及CFSCs-CM抑制瘢痕提供可靠的实验基础。但CFSCs-CM中含有诸多细胞因子、外泌体等介质，到底是何种因子在瘢痕的抑制过程中发挥着关键作用，这些因子之间以及因子与细胞之间是否存在着相互影响，尚有待进一步研究。

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[收稿日期]2020-11-13

本文引用格式：陈俊男，李治桦，赖琳英，等.脂肪源性干细胞影响增生性瘢痕的机制研究[J].中国美容医学，2021，30（10）：1-5.