《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》标准中蛋白质含量的检测方法研究

2021-12-14于浩姜爱莉李敏付步芳王召旭

中国美容医学 2021年10期

于浩　姜爱莉　李敏　付步芳　王召旭

[摘要]目的：建立整形手術用交联透明质酸钠凝胶产品中蛋白质含量的标准检测方法，为行业标准YY/T 0962-2014《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》的修订提供实验依据。方法：采用酸解法处理样品，考察了酸的种类、酸解时间等影响因素，用0.5mol/L硫酸溶液且在（95±5）℃恒温干燥箱45min中将样品完全溶解，利用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合显色的原理，以牛血清白蛋白为对照品，采用分光光度法在波长595nm处测定样品中蛋白质的含量，且委托第三方三所实验室对方法进行验证，对数据结果进行双因子方差分析。结果：该方法专属性较高，蛋白浓度在2～10μg/ml，回归方程y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），校正曲线的线性关系良好，样品测定重复性RSD均值为3.19%，回收率结果98.70%，检出限为0.96μg/ml，四所实验室对同批次样品进行测定，采用双因子方差分析，得到P值为0.253>0.05，认为不同实验室采用同一方法对同批次样品的蛋白测定结果不存在显著性差异。结论：该方法是一种简单、快速、准确测定整形手术用交联透明质酸钠凝胶产品中蛋白含量的检测方法。

[关键词]交联透明质酸钠凝胶;考马斯亮蓝法;蛋白质含量;注射整形;质量控制

[中图分类号]R318 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2021）10-0006-04

Study on the Detection Method of Protein Content in the Standard of Cross-linked Sodium Hyaluronate Gel for Plastic Surgery

YU Hao1，2，JIANG Ai-li1，LI Min1，2，FU Bu-fang2，WANG Zhao-xu2

（1.Yantai University，Yantai 264000，Shandong，China;2.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 102629，China）

Abstract： Objective To establish a standard detection method for protein content in cross-linked sodium hyaluronate gel products for plastic surgery， and to provide experimental basis for the revision of industry standard YY/T 0962-2014 Cross-linked sodium hyaluronate gel for plastic surgery. Methods The sample was treated by acid hydrolysis method， and the influencing factors such as the type of acid and acid hydrolysis time were investigated. The sample was completely dissolved in a 0.5mol/L sulfuric acid solution and （95±5）℃ constant temperature oven for 45min. The principle of blue G-250 combined with protein for color development， used bovine serum albumin as a control， used spectrophotometry to determine the protein content in the sample at a wavelength of 595nm， and entrusted three laboratories to the method perform verification and perform two-way ANOVA on the data results. Results The method has high specificity， protein concentration in the range of 2-10μg/ml， regression equation y=0.0125x-0.0033（r=0.9997）， the linear relationship of the calibration curve is good， and the average RSD of the sample measurement repeatability was 3.19%， the recovery rate was 98.70%， and the detection limit was 0.96μg/ml. The four laboratories measured the same batch of samples and used a two-factor analysis of variance to obtain P= 0.253>0.05. It was considered that there was no significant difference in the protein determination results of the same batch of samples by the same method in different laboratories. Conclusion This method is a simple， rapid and accurate method for determining the protein content of cross-linked sodium hyaluronate gel products for plastic surgery.

Key words： cross-linked sodium hyaluronate gel; coomassie brilliant blue method; protein content; injection plastic; quality control

透明质酸（Hyaluronan，Hyaluronic acid，HA）是一种广泛分布在软结缔组织细胞外基质中的线状聚阴离子酸性黏多糖，具有维持皮肤稳定以及保持皮肤弹性的功能[1]。1995年，HA类皮肤填充剂通过欧盟批准首次进入欧洲市场，2003年，被美国食品药品监督管理局（Food and drug administration，FDA）正式批准用于整形美容行业，一般用于修复皮肤褶皱，通过外部充填而达到理想的美容效果[2]。通常选择交联技术，使产品具有更强的抗酶解性能和良好的流变学性能等，以达到理想的使用周期[3]。该类产品具有生物相容性较好、安全性较高以及应用多样化等优势，受到整形美容行业青睐[4]。国家药品监督管理局网站中可查询到进口的注射用交联/修饰透明质酸钠凝胶的注册证共23个。

现行的行业标准YY/T 0962-2014《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》于2014年发布，2015年开始实施。随着技术的发展，目前该标准的部分内容和指标已经不能适应行业的进步与发展。例如，HA中蛋白质含量是必须严格控制的，蛋白质含量高于1%时，机体易产生抗原反应，往往会出现过敏现象[5]。现行标准中仅对HA原料中的蛋白含量有所要求（不得高于0.1%），未对交联透明质酸钠凝胶中的蛋白含量进行控制。在由HA到交联透明质酸钠凝胶的生产过程中，还需要碱化、透析等多步工艺，过程繁琐且耗时较长，有可能接触新的蛋白质污染源，从而使产品中的蛋白质含量发生改变，因此不能简单的用原料中的蛋白质含量来推算产品中的蛋白质含量。笔者建立了交联透明质酸钠凝胶产品中蛋白质含量的测定方法，采用酸解工艺对产品进行处理，并探索出合适的酸解条件，如所用酸的种类，酸解时间等，然后采用考马斯亮蓝法对蛋白质进行测定。

1 资料和方法

1.1 仪器和试剂：数控超声波清洗器（苏州江东精密仪器有限公司，型号：VGT-2120QTD，频率：40kHz）;电子分析天平（深圳市盛美仪器有限公司，型号：XSE205DU）;紫外-可见分光光度计（日本日立公司，型号：日立U-3310）。

交联透明质酸钠凝胶样品（样品1批号：H181217A11C;样品2批号：36923128;样品3批号：20190102;样品4批号：H190123B11A;样品5批号：H181219A11A）;磷酸（≥85%，国药集团化学试剂有限公司，批号：20181019，分析纯）;95%乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20170103，分析纯）;盐酸（36%～38%，国药集团化学试剂有限公司，批号：20181009，分析纯）;硫酸（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150429，分析纯）;考马斯亮蓝G250（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160114，分析纯）;牛血清白蛋白（≥98%，北京欣经科生物技术有限公司，批号：B76636，分析纯）。

1.2 实验方法：考马斯亮蓝法和福林酚法是两种常见的蛋白质含量测定方法，考察了这两种方法对本产品的适用性。

1.2.1 考马斯亮蓝法：在酸性环境中，考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质中的碱性氨基酸（尤其是精氨酸和赖氨酸）以及芳香族氨基酸的残基通过疏水力相结合，最大吸收峰由465nm变为595nm[6]。蛋白质浓度1～1 000μg/ml，蛋白质-染料复合物在595nm的吸光度与蛋白含量成正比，故可用于蛋白质含量的测定，原理如图1。

1.2.1.1 溶液的配制：考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝G-250 100mg，加95%乙醇50ml，待考马斯亮蓝溶解后（可使用超声），再加85%磷酸100ml，纯化水定容至1 000ml，混匀，滤过，取滤液即得。本染色液应置棕色瓶内，宜配制24h后使用。如有沉淀生成，使用前需经滤过。

对照品溶液：称取0.010g牛血清白蛋白于100ml容量瓶，稀释10倍至浓度约10μg/ml。

0.5mol/L硫酸：加入適量纯化水于1L容量瓶中，取硫酸27.2ml于容量瓶中，继续加纯化水定容混匀。

1.2.1.2 标准曲线系列浓度溶液：准备6只洁净棕色具塞比色管，取上述标准储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml于具塞比色管中，分别加1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml纯化水，混匀得到系列浓度的标准品。

1.2.1.3 实验最佳条件的选择：称取交联透明质酸钠凝胶2.000g，置20ml顶空瓶中，加0.5mol/L硫酸溶液3.0ml，压紧瓶盖，置（95±5）℃恒温干燥箱45min，使之完全溶解。冷却至室温后，将顶空瓶中溶液转移至10ml棕色容量瓶，用3.0ml 1mol/L氢氧化钠溶液润洗顶空瓶，将润洗液转移至容量瓶，纯化水定容至10.0ml，从中吸出1.0ml置棕色试管中，在标准液系列各试管和样品试管中分别加入考马斯亮蓝G-250染料试剂5.0ml，小心涡旋混匀，室温下反应5min，以空白溶液作参比，595nm波长处测定吸光度。

酸解时间：为考察酸解时间对样品酸解效果的影响，分别设置30min、45min和60min的酸解时间点，其他操作按照1.2.1.3的实验方法进行。

酸性环境：考马斯亮蓝G-250染料在试剂配制过程中需加入磷酸溶液，起到调节pH的作用，使考马斯亮蓝溶液呈酸性。后期测定之前可加入50μl磷酸以调节酸性环境，对是否补加磷酸做对比实验，考察磷酸的影响，其他操作按照1.2.1.3的实验方法进行。

酸的选择：交联透明质酸钠凝胶酸解通常采用硫酸或盐酸，分别考察了两种酸的适用性，为验证蛋白质在1mol/L盐酸溶液和0.5mol/L硫酸溶液中95℃条件下是否被破坏，分别加入高中低三个浓度的蛋白质标准品溶液，进行回收率试验的测定，其他操作按照1.2.1.3的实验方法进行。

1.2.1.4 线性关系考察：以牛血清白蛋白对照品溶液的浓度（μg/ml）为横坐标，吸光度值A为纵坐标，在蛋白浓度2～10μg/ml范围内绘制标准曲线。

考马斯亮蓝法按如下公式计算交联透明质酸钠凝胶中蛋白质的含量：

E=（a×V）/m

1.2.1.5 精密度：取樣品1适量，按照1.2.1.3的实验方法，连续进行6次分析，记录吸光度值，并计算相对标准偏差（Relative standard deviation， RSD）。

1.2.1.6 稳定性：取样品2适量，按照1.2.1.3的实验方法，每隔5min进行一次检测，30min内进行7次分析，记录吸光度值，并计算RSD。

1.2.1.7 重复性：平行取样品2、样品3和样品4适量，各6份，按照1.2.1.3的实验方法，分别进行测定，记录吸光度值，计算含量及RSD。

1.2.1.8 加标回收率：分别称取3份2.000g样品5置20ml顶空瓶中，加0.5mol/L硫酸溶液3.0ml，不加振荡，分别加入40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml牛血清白蛋白标准溶液各1.0ml后，压紧瓶盖，置（95±5）℃恒温干燥箱中45min，使之完全溶解。冷却至室温后，将顶空瓶中溶液转移至10ml容量瓶，用3.0ml 1mol/L氢氧化钠溶液润洗顶空瓶，将润洗液转移至容量瓶，最后纯化水定容。平行制备3份，然后同1.2.1.3的实验方法进行测定，并计算对应的加标回收率及RSD。

1.2.1.9 检出限：连续进行10次空白测试，按公式计算检出限：

1.2.2 福林酚法：标准曲线系列溶液的配制和样品的制备同考马斯亮蓝法，操作步骤按照2020版中国药典中福林酚法的要求进行[7]。

1.2.3 多所实验室验证：就起草验证工作进行了安排和分工，就工作时间结点与验证工作组成员进行了确认，由本单位进行方法建立，即中国食品药品检定研究院（实验室Z），组织国内多所具有检测资质的实验室对该方法进行验证，包括杭州协合医疗用品有限公司（实验室X）、北京蒙博润生物科技有限公司（实验室M）以及爱美客技术发展股份有限公司（实验室A），采用考马斯亮蓝法，按照1.2.1.3 的实验方法开展同一方法的验证工作，对同批次样品1、样品3进行蛋白质含量的测定，采用Minitab 16对数据进行统计学处理，对其进行双因子方差分析。

2 结果

2.1 考马斯亮蓝法

2.1.1 实验最佳条件的选择

2.1.1.1 酸解时间：选择30min、45min、60min三个样品酸解时间。30min时，可以看到顶空瓶中有明显颗粒，没有酸解完全，未进行下一步操作。加热45min和60min后顶空瓶中的样品完全酸解，未发现颗粒物质，两个加热时间的蛋白含量测定结果分别是13.209μg/g、13.734μg/g，结果差距不大，且在45min时酸解效果已稳定，故选择45min为样品的最终酸解时间。

2.1.1.2 酸性环境：在标准液系列各试管和供试品试管中分别加入50μl磷酸，再分别加入考马斯亮蓝G-250染料试剂5.0ml进行蛋白含量测定时，回归方程为：y=0.0079x-0.0014（r=0.9981），未补加磷酸的回归方程为：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997）。由表1数据可知，补加磷酸后的方法线性相对较差且吸光度明显变小，故选择测定之前无需加入磷酸的方法。

2.1.1.3 酸的选择：采用1mol/L盐酸溶液对交联透明质酸钠凝胶样品进行消解后，回归方程为：y=0.0104x-0.0090（r=0.9972），平均回收率为112.10%，RSD为6.74%，回收率偏高;采用0.5mol/L硫酸溶液的回归方程为：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），平均回收率为98.70%，RSD为7.68%。并且考虑到盐酸溶液存在挥发的可能，故将盐酸溶液换成硫酸溶液。

2.1.2 线性关系考察：标准曲线见图2，回归方程为：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），对照品含量在2～10μg/ml的浓度范围内线性关系良好，表明蛋白质在此浓度范围内与吸光度之间符合Lamber-Beer定律。

2.1.3 精密度：连续进行6次分析，吸光度值分别是0.030、0.030、0.031、0.029、0.030、0.031，RSD为2.50%，可知方法精密度良好。

2.1.4 稳定性：每隔5min进行一次检测，30min内进行7次分析，吸光度值分别是0.023、0.026、0.025、0.024、0.024、0.024、0.023，RSD为4.43%，可知该方法在30min内样品显色稳定。

2.1.5 重复性：对样品2、样品3、样品4分别进行6次重复测定，由表2数据可知，RSD均值为3.19%，可知方法重复性良好。

2.1.6 加标回收率：设定3个加标梯度，数据结果见表2～3，计算得出，该方法的平均回收率为98.70%，RSD为7.68%，表明方法测量准确度良好。

2.1.7 检出限：10次空白测定吸光度值分别为：0.078、0.074、0.083、0.072、0.077、0.083、0.078、0.080、0.079、0.072，空白测定标准偏差为0.0040，标准曲线斜率为0.0125，根据公式计算检出限，结果为0.96μg/ml。

2.2 福林酚法：采用福林酚法测定结果，回归方程为：y=0.0120x-0.0138（r=0.9997），线性关系虽然良好，但该种方法样品管加入显色剂后，颜色有干扰。

2.3 多所实验室验证结果：四所实验室按照1.2.1.3的实验方法对样品1、3进行蛋白含量测定，采用Minitab 16对数据进行统计学处理，采用双因子方差分析，显著水平P=0.253>0.05，因此得出多所实验室对样品1、3的测定结果不存在显著性差异，结果表明该方法测定整形手术用交联透明质酸钠凝胶产品中的蛋白质含量具有可行性和可靠性。见表4。

3 讨论

对考马斯亮蓝法和福林酚法的检测结果和理论机制进行分析，福林酚法的检测结果明显高于考马斯亮蓝法，考虑到前者的干扰因素很多，包括酚类、多肽、硫酸铵等，而交联透明质酸钠凝胶样品中存在除蛋白以外的多肽类杂质，检测过程中也会和福林酚发生反应，造成结果偏高，认为该方法不适用于整形手术用交联透明质酸钠凝胶中蛋白质含量的测定。

交联透明质酸钠凝胶不溶于水，需要溶解后才能将交联网络中残留的蛋白质释放出来，同时还需不影响蛋白质的测定。酸水解不充分，凝胶中的蛋白质不能完全溶出;水解过度可能会使样品中的蛋白质水解成单体氨基酸或低分子肽（考马斯亮蓝试剂不与单体氨基酸及相对分子量小于3kDa的多肽结合[8]），影响结果准确性。采用考马斯亮蓝法，对酸解条件进行优化，考察了酸的浓度以及酸解时间等因素，最终确定了0.5mol/L硫酸溶液3ml，在（95±5）℃恒温干燥箱消解45min的酸解条件。该方法稳定性和重复性较好，精密度和准确度较高，且通过四所实验室开展同一方法的验证工作，对其检测数据进行双因子方差分析，测定结果不存在显著性差异，得出本次建立的整形手术用交联透明质酸钠凝胶产品中蛋白质含量的测定方法具有可行性和可靠性，可作为标准检测方法推广应用。

在实验操作过程中忽视某些细节也会直接影响反应结果，例如考马斯亮蓝G-250与石英比色皿（成分为二氧化硅）产生强烈的结合，因此本实验建议使用玻璃或塑料比色皿;考马斯亮蓝分子结构对光照敏感，光照强烈会使显色剂吸收光谱发生改变，造成检测结果出现较大波动，因此需采用棕色试剂瓶且避光测定[9];考马斯亮蓝染色液在配制时，应先加入考马斯亮蓝G-250粉末和乙醇，必须保证考马斯亮蓝G-250溶解后再加磷酸（可使用超声），最后用纯化水定容在棕色容量瓶中，24h后使用效果更佳，使用前需过滤;称取交联透明质酸钠凝胶时，需置于顶空瓶的底部，避免沾到瓶壁影响酸解，加入硫酸后，需轻拿轻放，勿摇晃顶空瓶;此外，在检测时效上，时间因素对复合物稳定性的影响较为显著，因此需两人配合测定吸光度以加快速度，保证时间的一致性。

致谢：在此，十分感谢杭州协合医疗用品有限公司、北京蒙博润生物科技有限公司、爱美客技术发展股份有限公司以及相关领域专家对YY/T《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》行业标准的修订内容和补充验证情况做出的努力，对该行业的发展具有重要意义。

[参考文献]

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[2]薛紫涵，芦笛，李桂珍，等.面部韧带根部填充透明质酸改善轻中度面部老化[J].中国美容医学，2019，28（3）：1-4.

[3]王彤，成亚飞，陈诚，等.透明质酸在烧伤整形美容外科中的应用

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[4]赵喜迎，王磊，谭谦，等.透明质酸填充鼻唇沟的临床应用进展[J].中国美容医学，2019，28（3）：161-163.

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[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].4版.北京：中医药科技出版社，2020：107-108.

[8]蒋大程，高珊，高海伦.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中的细节问题[J].试验科学与技术，2018，16（13）：119-122.

[9]趙卓，籍浩天，刘东波，等.光照对考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度影响的研究[J].吉林师范大学学报（自然科学版），2015，37（2）：112-116.