胚胎冻存时间对冻胚周期临床结局和新生儿结局的影响

刘艳丽，申峻涵，张玉超，王兴玲，武文斌，杜姗姗，胡继君，管一春

郑州大学第三附属医院生殖医学中心 郑州 450052

在辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)中，胚胎冷冻保存已成为临床常规工作。它不仅降低了卵巢过度刺激综合征的发生，提高ART治疗的安全性，还有利于提高单个取卵周期的胚胎利用率和累积妊娠率，降低治疗费用[1]。此外，对于因病情需卵巢切除或进行放化疗且有生育要求的已婚患者，治疗前冻存胚胎可有效保存生育力。但胚胎发育潜能和临床结局是否受到冷冻保存时长的影响成为广大医务人员和患者关注的焦点问题，且目前的文献报道[2-6]并无一致结论。为此，本文分析了胚胎经玻璃化冷冻后保存时间对临床结局和新生儿结局的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2016年1月1日至 2019年9月30日在郑州大学第三附属医院生殖医学中心进行冻融胚胎移植病例。纳入标准：①女方年龄≤37岁。②移植周期≤3次。排除标准：①胚胎植入前接受遗传学诊断/胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic diagnosis/screening，PGD/PGS)者。②复苏后无可利用胚胎者。③供卵患者。④序贯移植者。⑤移植胚胎的冷冻时间不一致者。

1.2 胚胎冷冻方案的制定接受体外受精联合胚胎移植技术(invitrofertilization and embryo transfer，IVF-ET)的患者取卵后第3天到院被告知胚胎情况，临床医师和胚胎学家根据患者自身情况和胚胎情况，个性化制定冷冻方案。直接冷冻保存第3天胚胎(D3胚胎)或者继续培养2～4 d形成囊胚后冷冻保存。D3胚胎冷冻标准是每管≤2个胚胎；囊胚的冷冻标准为前3管每管1个囊胚，第4管及以后每管2个囊胚。患者签署胚胎冷冻保存知情同意书。

1.3 胚胎冷冻及复苏

1.3.1卵裂期胚胎冷冻标准 胚胎发育的第3天，选择4细胞及以上的Ⅰ～Ⅲ级[7]可利用卵裂期胚胎进行冷冻，其中Ⅰ级和Ⅱ级胚胎为优质胚胎。

1.3.2囊胚的冷冻标准 胚胎发育的第5至第7天，选择级别为3BC以上的囊胚[8]进行冷冻，其中3BB及以上的囊胚为优质囊胚，囊胚冷冻前进行激光皱缩。

1.3.3冷冻方法 使用的冷冻液和解冻液均购自日本加藤公司。冷冻液在室温下平衡至少30 min，将胚胎置于玻璃化冷冻平衡液中平衡10 min，待细胞内水分和冷冻保护剂充分置换后，转入玻璃化冷冻液中平衡，1 min内移至冷冻载杆上并迅速投入液氮中保存。冷冻操作均在室温下进行。

1.3.4复苏方法 移植当日复苏胚胎。将复苏液1在37 ℃培养箱中平衡30 min，复苏液2、3、4在室温下平衡30 min。复苏时，将载杆尖端迅速投入复苏液1中，约1 min后将胚胎依次转入复苏液2、3、4中各停留3 min，然后转入G-2培养皿中。复苏操作第一步在37 ℃工作台上进行。

1.3.5胚胎复苏成功的标准 卵裂期胚胎至少一半卵裂球存活，囊胚复苏2 h后囊胚腔扩张为复苏成功。复苏后至少培养2 h后再移植。所有冻融胚胎移植前均行激光辅助孵化。

1.4 内膜准备对于月经规律、排卵正常的患者，采用自然周期准备内膜；对于月经不规律或无排卵、月经不调、多囊卵巢综合征及黄体功能不全的患者，采用激素替代周期准备内膜；对于月经周期长、排卵障碍、多囊卵巢综合征、子宫内膜厚及有雌激素应用禁忌证的患者，采用刺激周期准备内膜。

1.5 随访胚胎移植后第14天进行血清β-HCG水平测定；对于血清β-HCG阳性(≥50 IU/L)的患者，于移植后第35天阴超检测孕囊。后期进一步随访异位妊娠率、流产率、活产率、早产率、新生儿出生孕周、出生体重、性别比及出生缺陷等指标。

2 结果

2.1 患者的基本资料本研究共纳入8 338个冻胚周期，根据胚胎冻存时间(<4个月，4～个月，7～个月，13～个月，25～个月和≥37个月)分为6组，记为第1～6组，6组基本资料详见表1。由表1可知，胚胎移植时女方年龄均随保存时间延长而增加(P<0.001)；各组间女方BMI和内膜厚度差异无统计学意义，原发性不孕症占比随保存时间的延长而降低。不孕的主要原因是输卵管性不孕，其次是男性不育；冻胚移植周期中囊胚移植占很大比例，且以单囊胚移植为主，卵裂期胚胎以移植两枚D3胚胎为主。

表1 6组的基本资料

2.2 6组临床结局的比较6组冻融胚胎的复苏率、血HCG阳性率、临床妊娠率、早期胚胎丢失率和异位妊娠率差异无统计学意义(P>0.05)；各组之间种植率、流产率、活产率、早产率和双胎率之间差异有统计学意义(P<0.05)，但校正女方年龄、BMI、周期数、移植胚胎阶段、移植胚胎数量和优胚数量、内膜准备方案等潜在混杂因素后发现，除了第6组和第1组的种植率差异有统计学意义(P=0.034)外，其余各组之间的流产率、活产率、早产率和双胎率差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2、3。

表2 6组临床结局的比较 %

2.3 胚胎不同冻存时间的新生儿结局见表4。由表4可知，移植不同冻存时间的胚胎活产婴儿中，各组之间早产儿占比、男婴占比、低体重儿占比，分娩孕周、身长和出生体重及出生缺陷占比差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 不同冻存时间胚胎移植临床结局的优势比*

表4 不同冻存时间胚胎移植的新生儿结局

续表4

3 讨论

自1983年人类首例冻融胚胎移植获得妊娠并活产后[9]，玻璃化冷冻胚胎技术作为一项常规且成熟的技术应用于临床已40余年。随着冻存时间延长，玻璃化胚胎长期低温保存的安全性已成为辅助生殖医生关注的焦点问题。理论上，在-196 ℃液氮中，胚胎的代谢受到抑制，原则上可长期保存。Machtinger等[10]生物学家推测哺乳动物胚胎在液氮中冻存几千年，细胞仍然可以存活；Dowling-Lacey等[11]报道了冷冻保存时间最长的临床妊娠案例(冻存20 a的供卵体外受精形成的胚胎进行复苏移植并活产)。

但也有研究[12]认为玻璃化冷冻虽能使细胞及细胞外环境固化为“玻璃状”，大分子扩散迁移率受到限制，但根据低温生物学原理，分子局部小运动仍可在玻璃化转变温度(Tg)附近或Tg以下流动；也有学者[13]认为胚胎在低温冻存过程中，与低温保护剂相关的自由基及其毒性作用可能导致胚胎DNA片段增加；再者，除了冷冻保护剂的毒性作用，胚胎在冻存过程中可能受到宇宙背景的影响而改变等。中华医学会生殖医学分会胚胎冷冻保存时限的中国专家共识建议胚胎冷冻保存时间不超过10 a，认为胚胎冷冻时间过长可能对胚胎的潜能造成一定影响[14]。因此，本研究分析了延长胚胎冻存时间是否对冻胚移植的临床结局和新生儿结局造成不良影响。

根据2018年《胚胎植入前遗传学诊断/筛查专家共识》[15]中将女方年龄≥38岁或3次移植种植失败定为符合胚胎植入前筛查的条件(可能存在胚胎染色体异常率较高、反复着床失败等)，本研究对象纳入标准为女方年龄≤37岁，移植周期≤3次，排除高龄和多周期患者对移植结局产生的偏移和干扰，这样的纳入标准是为了在预后相对较好的人群中探讨冷冻保存时间对冻融胚胎移植后临床结局的影响。本研究的基本资料中，各组间女方年龄差异有统计学意义，且随着冻存时间增加而呈增加趋势，可能与分组较多且纳入样本量较大有关；男方年龄与女方年龄保持相同的趋势。原发不孕的占比随着冻存时间增加而降低，其原因可能是原发不孕患者一般会在半年内进行胚胎移植，更迫切获得妊娠；继发不孕患者多有生育史，二胎生育占比较高，所以冻存时间相对于原发不孕较长。

在本研究中，随着胚胎冻存时间的延长，冷冻胚胎的复苏率并非呈下降趋势，且冻存时间≥37个月组的复苏率(99.2%)在各组中最高，说明了冻存时间延长不影响胚胎的完整性；胚胎种植率能进一步说明胚胎的活性和发育潜能，冻存时间在25～个月组和≥37个月组的种植率(48.4%vs54.6%)都稍高于其他各组，可能与基本资料所显示的后两组所移植的胚胎中囊胚占比较高有一定的关系(72.2%vs66.7%)，课题组之前的数据[16]也说明了囊胚有更高的种植率和临床妊娠率，所以后两组的临床妊娠率和活产率也表现了相似的趋势。校正了混杂因素以后，发现冻存时间≥37个月组的种植率明显高于<4个月组的种植率，进一步证实了冻存时间不会对胚胎的活力和潜能造成不良影响。同时分析患者病史和病因，发现≥37个月组男方因素和输卵管因素占比较高，病因较为明确，而体外受精恰恰能解决这一问题，这也可能是≥37个月组胚胎种植率较高的一个重要原因。

为了更准确说明冻存时间延长与临床结局和新生儿结局的关系，在校正了潜在混杂因素后，发现不同冻存时间组临床妊娠率、活产率、流产率等差异均无统计学意义。查阅国内外关于冻存时间与临床结局的文献，发现结论也不一致：Testart等[17]研究结果显示人类胚胎经过几个月冷冻保存后，胚胎存活率和妊娠率降低，但此研究未控制冷冻前胚胎的状态；Ryan等[18]在IVF患者和供卵患者的研究中发现原核期或卵裂期胚胎经过不同时间的冻存后临床结局均不受影响；Liu等[19]和Yuan等[20]报道胚胎冻存时间不影响复苏率和临床结局，但这3项研究为程序化冷冻法。关于玻璃化冻存时间对临床结局的影响有如下报道：Wirleitner等[21]回顾性分析603个周期玻璃化冷冻囊胚保存6 a，对胚胎存活率、植入率和新生儿预后均无负面的影响，但其局限性是样本量小；Ueno等[22]学者研究35～39岁人群且诊断为输卵管因素不孕症和既往移植周期失败的患者显示，玻璃化囊胚的低温保存时间与妊娠和新生儿结局亦无显著关系，因纳入标准问题，Ueno的结论适用于高龄患者，用于其他患者可能存在选择偏差；Li等[2]的研究显示胚胎的冷冻保存时间和临床结局呈负相关，但最长保存时间为24个月，对胚胎冻存时间≥24个月的患者胚胎冷冻保存无法准确评估。

随着玻璃化冷冻技术的广泛应用，有越来越多玻璃化冷冻胚胎的新生儿出生。本研究发现移植不同冻存时间的胚胎，不会影响新生儿结局，包括分娩孕周、早产儿占比、性别比、出生体重和身长、低体重儿占比及出生缺陷占比。众所周知，出生体重是评价围生期结局的常用指标，低体重与新生儿死亡率相关。本研究中单胎和双胎新生儿的出生体重和低体重儿占比均不受胚胎冻存时间的影响。其他学者的研究亦显示了相似的结果：Liu等[19]研究显示程序化冷冻的卵裂期胚胎移植后子代出生孕周、单胎体重和低体重儿占比差异均无统计学意义；Li等[23]分析了玻璃化冷冻的卵裂期胚胎不同保存时间的男女出生比例、孕周和单胎出生体重等新生儿结局差异均无统计学意义；Li等[2]研究结果显示，在2 a的冻存时间内，延长冻存时间后新生儿体重和出生缺陷率差异无统计学意义。

查阅文献，胚胎冻存时间对临床结局影响的研究相对较少，关于新生儿结局的研究更为有限，且未发现在预后较好人群中研究玻璃化冻存时间对胚胎活力、临床结局和新生儿结局的影响。本研究纳入女方年龄≤37岁，移植周期≤3次人群，发现冻存时间延长不会对临床结局和新生儿结局产生负面影响，可以帮助临床医生在进行冻胚选择时，不用再担心冻存时间对其造成不良影响；但不同冻存时间胚胎出生新生儿的生理和心理健康，需要更长期随访。因此，冻融胚胎的远期安全性还需更长时间的医学观察和相关研究加以佐证。