食管鳞状细胞癌组织中miR-206的表达及与预后的关系

韩 娜，张彦彦，张中冕，张 芳，曾腾远，赵文超

1)郑州大学第二附属医院肿瘤科 郑州 450014 2)郑州大学基础医学院生理学与神经生物学系 郑州 450001

食管癌是世界范围内常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和病死率均居世界恶性肿瘤的前列[1]。中国是食管癌高发区，发病人数和死亡人数约占全球的50%[2-3]，而且90%以上是食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。ESCC缺乏早期特异性症状，确诊时多数患者已经发展成晚期，造成ESCC预后较差，5 a生存率较低[4]。因此，寻找有效的预测指标和治疗靶点对于ESCC的防治具有重要意义。miR-206是含有21个核苷酸的微小RNA，定位于人染色体6p12.2，在胃癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌及宫颈癌等肿瘤中的表达降低，对多种肿瘤的发生发展起到了重要作用[5-9]。但是，miR-206在ESCC中的表达及作用并不明确。本研究采用实时荧光定量PCR检测了miR-206在ESCC及癌旁组织中的表达，分析miR-206表达与ESCC临床病理特征和预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2013年6月1日至2014年11月1日于郑州大学第二附属医院进行手术治疗的ESCC患者136例,收集手术切除后的ESCC组织以及配对的癌旁正常组织标本(距离肿瘤边缘≥2 cm)，保存于-80 ℃低温冰箱中。患者术前均未接受过化疗、放疗以及其他抗肿瘤治疗。肿瘤分级、TNM 分期按照国际抗癌联盟/美国癌症联合会2017年第8版食管癌分期标准：高分化29例，中分化79例，低分化28例；Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期104例；N0+N1期77例，N2+N3期59例。136例中，男102例，女34例，年龄39～76岁，中位年龄(四分位数)60(56,68)岁,其中≤59岁66例，>59岁70例。电话随访调查患者预后(终点事件为死亡)，时间截至2019年12月1日，共得到完整数据84例，删失数据52例。本研究经郑州大学第二附属医院伦理委员会审查后批准，所有患者或家属均签署了知情同意书。

1.2 主要试剂Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司，miScript Ⅱ RT 试剂盒、下游通用引物和U6引物购自德国QIAGEN公司，FastStart Essential DNA Green Master购自瑞士罗氏公司，上游引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 ESCC和癌旁组织中miR-206表达水平的检测总RNA的提取及反转录：将组织标本研磨成粉后加入Trizol试剂裂解，加入氯仿沉淀蛋白后离心取上清，加入异丙醇沉淀RNA，体积分数75%的乙醇洗涤，取沉淀离心两次，无酶水溶解沉淀后测定浓度，按照说明书采用miScript Ⅱ RT试剂盒进行反转录获取cDNA。

miR-206上游引物序列：5’-TGGAATGTAAG GAAGTGTGTGG-3’。PCR反应体系：含10 μL荧光染料(FastStart Essential DNA Green Master)，上、下游引物各4 μL(终浓度均为0.4 μmol/L)，cDNA 0.4 μL，无酶水1.6 μL。反应条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃10 s，40个循环。以U6为内参，计算2-ΔΔCt作为miR-206的表达水平。

1.4 统计学处理应用SPSS 21.0进行分析。采用配对t检验比较ESCC和癌旁组织中miR-206表达水平的差异，χ2检验分析miR-206表达与患者临床病理特征的关系。用Kaplan-Meier和Log-rank检验分析不同miR-206表达患者生存状况的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ESCC和配对癌旁组织中miR-206的表达ESCC组织中miR-206表达水平为(0.82±1.10)，低于配对癌旁组织(1.60±1.37)(t=5.972，P<0.001)。

2.2 不同临床病理特征ESCC患者miR-206表达的比较以中位数0.235 6为界值，将136例ESCC患者分为miR-206低表达组(≤0.235 6)和miR-206高表达组(>0.235 6)，结果(表1)表明，肿瘤直径<5 cm、浸润深度T1+T2者miR-206高表达率更高(P<0.05)。

表1 miR-206的表达与ESCC临床病理特征的关系

2.3 miR-206的表达与ESCC患者生存的关系生存分析结果表明，miR-206低、高表达组的生存状况差异有统计学意义(χ2=5.425，P=0.020)，miR-206低表达组中位生存期(P75,P25)为21.7(10.8,44.0)个月，低于高表达组的29.9(12.7,51.1)个月(图1)。

图1 两组患者的生存曲线

3 讨论

miR-206是一种微小RNA，属于myomiR家族,在骨骼肌中特异性表达，对骨骼肌的生成具有重要的调控作用[10]。同其他微小RNA类似，miR-206可与靶基因mRNA的3’末端非翻译区结合，在转录水平负性调控基因的表达[11]。肿瘤的相关研究[5-9]表明，miR-206在胃癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌及乳腺癌等多种肿瘤中的表达降低，分别通过增加黏蛋白、Bcl2相关永生基因3、血管内皮细胞生长因子、SOX9、Smad3、M2型丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以及表皮生长因子受体等多种靶基因促进肿瘤细胞的增殖、侵袭转移以及血管形成。但是，miR-206在ESCC中的表达及其临床意义并不明确。

本研究发现，miR-206在ESCC组织中表达降低，表明miR-206可能作为抑癌基因在ESCC的发生发展中发挥重要作用，同miR-206在其他肿瘤中的作用[5-9]一致。此外，本研究还发现，miR-206的表达与ESCC患者的年龄、性别、肿瘤分级、TNM分期以及淋巴结转移无关，但是miR-206的高表达与肿瘤大小有关，与在乳腺癌中的研究[12]结果类似。也有研究[13-14]表明，miR-206的表达与肺癌及胃癌的大小无关，而是与TNM分期和淋巴结转移有关，推测可能与肿瘤组织的差异性、标本的数量以及检测方法有关。本研究还发现，miR-206的表达与浸润深度有关，浸润深度T1+T2者，miR-206表达水平高，与胃癌中的相关研究[15-16]结果类似。相关离体实验[5]表明，miR-206可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。结合上述文献和本研究结果，我们推测，miR-206在ESCC组织中的表达降低，可能具有促进ESCC细胞侵袭的作用。在肺癌、卵巢癌、宫颈癌及乳腺癌的研究[6-9]中发现，miR-206可抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。

生存分析发现，miR-206低表达的ESCC患者生存时间较短，与在其他肿瘤如胃癌和结直肠癌中的研究结果[16-17]一致，表明miR-206可能是ESCC患者预后的潜在标志物和治疗靶点。但是，Du等[18]对食管癌的研究发现，miR-206低表达患者的生存时间较长，与本研究的结果相反。食管癌有两种主要的病理类型，即腺癌和ESCC，而Du等的研究并未将这两种类型的食管癌加以区分，这可能是产生不同结果的原因。

综上所述，miR-206在ESCC组织中的表达降低，miR-206低表达者预后差，miR-206可作为ESCC预后预测及治疗的潜在靶点。