河南省2015至2019年李斯特菌病分子流行病学特征

炊慧霞，李薇薇，崔箐坡，贾松树，张秀丽，韩志伟

1)河南省疾病预防控制中心质量管理科 郑州 450016 2)国家食品安全风险评估中心 北京 100022 3)北京中科助腾科技有限公司 北京 100084

李斯特菌病是由单核细胞增生李斯特菌感染引起的食源性疾病，最长潜伏期可达70 d，发病率低，但住院率高(高达90%)、病死率高(20%～30%)，疾病负担较重[1-2]。在国内，李斯特菌病未被列入法定报告疾病，发病率及危害程度不清晰。2013年国家食品安全风险评估中心制定并建立李斯特菌病感染专项监测系统[3]，开展对李斯特菌病的监测，根据2019年国家食品安全风险评估中心的报告[3]，2013至2017年64家哨点医院共上报211例李斯特菌病，其中55例死亡，致死率为26.1%。

河南省于2015年加入该监测系统，2015至2019年从13家哨点医院共监测60例李斯特菌病病例，获得60株单核细胞增生李斯特菌菌株。为进一步了解河南省李斯特菌病病原学特征，完善河南省单核细胞增生李斯特菌分子溯源数据库，掌握其遗传进化特征及规律，进而筛选河南省流行性高致病克隆群菌株，探索其致病机制、流行原因，并为暴发识别及原因食品的确定提供技术支持和基线数据，本研究对这60株单核细胞增生李斯特菌进行了全基因组测序并进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)，分析主要毒力因子、耐药基因、谱系、血清群和分子分型等特征。

1 材料与方法

1.1 菌株来源2015至2019年河南省李斯特菌病感染专项监测系统监测的60例均具有李斯特菌病临床表现，其中有7例结局为死亡，致死率为11.7%。从患者的血液、脑脊液、宫腔拭子、痰液或粪便中共分离、上报60株单核细胞增生李斯特菌菌株。

1.2 试剂及仪器科玛嘉单增显色平板购自上海欣中生物工程有限公司，哥伦比亚血平板购自贝瑞特生物技术(郑州)有限责任公司。α-氰基-4羟基肉桂酸(HCCA)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪购自德国Bruker公司,微生物鉴定用质谱仪校正标准品由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所赠送，用于菌株鉴定。Seakem®Gold琼脂购自瑞士LONZA公司，溶菌酶和蛋白酶K均购自生工生物工程(上海)有限公司，限制性内切酶AscⅠ购自美国Thermo Scientific公司。细菌全基因组提取试剂盒购自大连宝生物公司，Qubit®dsDNA-HS分析试剂盒、Qubit 4.0荧光定量仪购自美国Life Invitrogen公司。上述培养基及试剂均在有效期内使用，且使用之前均经过技术性验收。脉冲场凝胶电泳仪CHEFMAPPER、凝胶成像系统GelDoc购自美国BioRad公司，DENSIMAT浊度仪购自法国生物梅里埃公司，高速冷冻离心机购自德国Sigma公司，N60-Touch超微量分光光度计购自德国IMPLEN公司。

1.3 单核细胞增生李斯特菌菌株全基因组测序将超低温冷冻保存的菌株划线接种于哥伦比亚血平板上，37 ℃培养18～24 h，挑取单个菌落再次划线接种于哥伦比亚血平板上，37 ℃培养18～24 h，用无菌超纯水制备成浊度约为5.0 MCF的菌悬液，参照细菌全基因组提取试剂盒操作手册进行基因组DNA提取。用超微量分光光度计测定基因组DNA纯度，用dsDNA-HS分析试剂盒定量，基因组DNA浓度>75 mg/L，最终体积60 μL。将提取的基因组DNA样品送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组测序。将原始数据导入基于BioNumerics 7.6cn建立的国家食源性疾病分子溯源网络(TraNet)进行组装和分析。

1.4 序列型、谱系和血清群分析利用BIGSdb-Lm数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)进行序列型、谱系和血清群分析[4]。克隆群(clonal complex，CC)型通过分类数据最小生成树确定，MLST的7个管家基因中仅1个位点不同视为同一CC型。

1.5 毒力因子的筛选利用BLASTN软件，通过与VFDB和BIGSdb-Lm数据库比对，对单核细胞增生李斯特菌毒力岛(Listeriapathogenicity island，LIPI)1、3和4，应激生存岛(stress survival islet，SSI)1和2进行筛选，设定核苷酸最小一致性为80%；通过与BIGSdb-Lm数据库比对，完成生物杀灭剂和重金属抗性基因(bcrABC、cadAC、emrE、emrC、qacA、qacC、Tn6188 qac)的筛选，设定核苷酸最小一致性为80%。

1.6 耐药基因的筛选利用ABRicate软件中的ResFinder数据库[5]完成耐药基因的筛选，核苷酸最小一致性设定为75%，最小覆盖设定为90%。

1.7 核心基因组多位点序列分型(cgMLST)利用BioNumerics 7.6cn完成cgMLST。cgMLST分析框架采用法国巴斯德方法，包括单核细胞增生李斯特菌EGD-e参考菌株上1 748个高度保守的核心基因[6]，等位基因差异数≤10视为同源，10～24视为可能相关，>25视为非同源。采用Categorical系数和Complete linkage方法，设置比例因子为1和容忍度为0，等位基因差异数为0认为是同一cgMLST型(即CL型)。

1.8 脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分子分型以沙门菌H9812(中国科学院微生物研究所)为PFGE相对分子质量标准用菌株。样本扩增产物用AscⅠ进行酶切，最后电泳获取图谱。将PFGE图像导入BioNumerics 7.6cn进行处理，选择Dice相关系数和非加权组平均(UPGMA)法，设置位置优化度和容许度为1.5%，相似度100%认定为同一带型。

2 结果

2.1 单核细胞增生李斯特菌来源标本的分布60株单核细胞增生李斯特菌中，来源于围生期病例39株(65.0%)，非围生期病例21株(35.0%)；60份血液标本检出单核细胞增生李斯特菌45株(75.0%)，脑脊液标本检出9株(15.0%)，其他标本检出6株(10.0%)。具体见表1。

表1 各类标本中单核细胞增生李斯特菌的检出情况 株

2.2 谱系、血清型、序列型和CC型分型结果60株分属2个谱系(Ⅰ和Ⅱ)，其中谱系Ⅰ为优势谱系，有41株(68.3%)。分属3个血清型(Ⅱb、Ⅱa和Ⅳb)，其中Ⅱb为优势血清型，有38株(63.3%)。分属18个序列型，其中ST87为优势型，有21株(35.0%)。分属13个CC型及2个未分CC型(ST619和ST382)，其中CC87为优势型(35.0%)，有21株(35.0%)；CC288包括ST2194和ST323，CC5包括ST1032和ST5，CC8包括ST2086和ST8，其余CC型仅包含1种ST型。具体见表2。

表2 60株单核细胞增生李斯特菌谱系、血清型、序列型及CC型的分布

2.3 耐药基因和毒力因子分布毒力岛携带情况见表3。60株均携带LIPI-1，prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB等6个毒力基因均为阳性；16株(26.7%)携带LIPI-3，IIsA(LMOf2365_1112a、IIsG(LMOf2365_1113)、IIsH(LMOf2365_1114)、IIsX(LMOf2365_1115)、IIsB(LMOf2365_1116)、IIsY(LMOf2365_1117)、IIsD(LMOf2365_1118)和IIsP(LMOf2365_1119))等8个毒力基因均为阳性；27株(45.0%)携带LIPI-4，70009、70010、70011、70012、70013和70014等6个毒力基因均为阳性。

表3 60株单核细胞增生李斯特菌毒力岛携带情况 株

60株均不携带生物杀灭剂抗性基因bcrABC、emrE、emrC、qacA、qacC和Tn6188 qac，均不携带重金属抗性基因cadC；6株(10.0%)携带重金属抗性基因cadA。17株(28.3%)携带SSI-1，2株(3.3%)携带SSI-2。

60株均携带耐药基因fosX，均不携带dfrG(Trimethoprim)和lnu(D)基因；2株(3.3%)同时携带fosX、mef(A)、msr(D)和tet(M)，分别来源于血液和脑脊液标本。

2.4 cgMLST分型结果60株分属52种CL型，每型包括1～5株菌，等位基因差异数在0～1 730，其中CL0029、CL0014、CL0032和CL0033是优势型。CL型相同的菌株其血清型、序列型和CC型也相同；但除CL0029型中有2株PFGE带型相同外，其他均不相同。根据cgMLST同源判断标准，共有12个同源性(包含41株)，其中一个同源性的9株菌中，有2株PFGE带型相同；其他菌株PFGE带型均不相同。具体见图1。

图1 cgMLST分型结果

2.5 PFGE分型结果60株共获得51种PFGE带型，每种带型包括1～4株菌，相似度为56.7%～100.0%，GX6A16.HA0030、GX6A16.HA0005、GX6A16.HA0023和GX6A16.HA0011为优势带型。4株菌为GX6A16.HA0030带型，菌株分离自2018年不同地区患者，标本为血液和脑脊液，包含Ⅱb和Ⅱa血清群，包含ST7、ST87和ST224序列型。3株菌为GX6A16.HA0005型，菌株分离自2016年和2018年不同地区患者，标本为血液，包含Ⅱb一种血清群，包含ST619和ST87两种序列型。3株菌为GX6A16.HA0023型，菌株分离自2017年和2018年不同地区患者，标本为血液，包含Ⅱb一种血清群，包含ST382和ST87两种序列型。2株菌为GX6A16.HA0011型，菌株分离自2016年和2018年不同地区患者，标本为血液，包含Ⅱb一种血清群，包含ST1032和ST87两种序列型。

3 讨论

李斯特菌病感染类型主要分为腹泻型和侵袭型两种，2015至2019年河南省李斯特菌病感染专项监测系统共监测到60例阳性病例，1例腹泻型病例阳性标本类型是粪便，59例侵袭型病例阳性标本类型是血液、脑脊液、宫腔拭子和痰液。

据报道[4，7-9]，单核细胞增生李斯特菌至少分为4个谱系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)，4个PCR血清群；人类李斯特菌病分离株主要属于谱系Ⅰ，ST87、ST3和ST7是其主要序列型；谱系Ⅱ菌株主要分离自人类和动物，尤其是食品。本组60株单核细胞增生李斯特菌谱系、血清型、序列型和CC型多样化，分属2个谱系(Ⅰ和Ⅱ)，3个血清型(Ⅱb、Ⅱa和Ⅳb)，13个CC型和18个序列型，其中优势谱系为Ⅰ，优势血清型为Ⅱb，优势CC型为CC87，优势序列型为ST87，与国外报道的优势序列型不同[10-11]。另外，本研究中谱系Ⅰ包含Ⅱb和Ⅳb两种血清群，谱系Ⅱ包含Ⅱa一种血清群，与文献[8]报道类似。本研究60例中有7例死亡，致死率为11.7%，低于全国致死率26.1%(χ2=5.490，P=0.020)。由7例死亡病例分离的菌株分属2个谱系，2个血清型，6个序列型，5个CC型，1个无CC型。

李薇薇等[12]报道单核细胞增生李斯特菌对磷霉素天然耐药，均携带耐药基因fosX。本研究中60株也均携带fosX；有2株同时携带mef(A)、msr(D)和tet(M)，可能对大环内酯类和四环素类抗生素耐药[13]。河南省分离的单核细胞增生李斯特菌耐药情况不严重。单核细胞增生李斯特菌的LIPI-1相对保守，对细菌进入胞内存活定植至关重要；LIPI-3编码李斯特菌溶血素S，在胃肠感染期发挥作用[14-15]；LIPI-4是新发现编码糖磷酸转移酶的毒力岛，具有高毒性，主要与神经系统和母婴感染相关[16]。本研究60株中，26.7%～100.0%携带1个毒力岛(LIPI-1、LIPI-3或LIPI-4)，16.7%～35.0%同时携带2个毒力岛(LIPI-1+LIPI-3或LIPI-1+LIPI-4)，10.0%同时携带3个毒力岛(LIPI-1+LIPI-3+LIPI-4)；这些同时携带1个以上毒力岛的菌株主要来自于血液标本，其次是脑脊液标本；携带LIPI-4的菌株的序列型包括ST87、ST382和ST619，提示这3种序列型菌株为高毒力株。

细菌中重金属抗性基因cadAC编码镉和锌外排泵机制，使菌株耐受重金属，单核细胞增生李斯特菌中该基因仅与镉耐受有关[17]。cadAC包括cadA和cadC，其中cadC编码产生的多肽是小分子可溶性蛋白，在菌株对重金属的耐受中必不可少。本研究中60株均不携带cadC，也不携带生物杀灭剂抗性基因bcrABC、emrE、emrC、qacA、qacC和Tn6188 qac，说明菌株对季铵盐类化合物和重金属消毒剂无抗性。SSI-1可增加单核细胞增生李斯特菌对酸、高温等极端环境的抗性，SSI-2则使菌株具有对碱性、氧化环境的抗性[12]。本研究中28.3%的菌株携带SSI-1，3.33%的菌株携带SSI-2，提示这部分菌株可在环境中长时间存在，增加污染食品和致病的风险。

全基因组测序分析技术分辨力强、分型能力强，已成为流行病学调查、分子溯源的重要工具。基于全基因组测序的cgMLST分型技术分辨力高、重复性好，有相对标准化的命名体系，是发达国家食源性疾病暴发调查的重要工具[18]。PFGE分型技术具有重复性好、分辨率高、偏于标准化及结果易于解释等特点，是近年来国家食品安全风险监测与食源性疾病溯源中要求的一项分子分型及溯源技术，该技术依托于网络化实验室实时监测、交换和数据比对，从而及时发现、识别聚集性。本研究中cgMLST和PFGE分型结果显示，60株分属52个CL型和51个PFGE带型，同一CL型菌株PFGE带型可以不相同。本研究中，按照cgMLST同源性标准，等位基因差异数≤10的12个同源性(包含41株菌)中只有1个同源性(包括9株菌)中的2株菌PFGE带型相同，cgMLST和PFGE聚类分析结果存在差异，提示在食源性疾病暴发调查分子溯源中可以联合使用这两种分型技术，以便获得更加准确的溯源结果；另外，因为时间或地区的差异，病例间不存在流行病学关联，cgMLST或PFGE聚类分析出现的聚集现象可排除病例感染同一来源。