驴乳清粉水解物改善D-半乳糖衰老小鼠衰老的相关机制研究

杨佳庆，陈兴浩，巫首燕，刘 庆，曹佳怡，张福梅

（1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 医学部，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030；4.甘南牦牛乳研究院，甘肃 甘南 747000）

生物活性肽是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物，对生命体的生命活动具有积极作用，并最终影响机体健康。乳源性活性肽因为其独特的营养价值备受关注[1]。国内外研究发现，乳清蛋白的水解产物不具有较强的羟自由基清除率[2-5]，但具有降低血清胆固醇[6]等作用。

在所有物种的乳制品中，驴乳的组成更接近母乳，且对患牛奶过敏的婴儿致敏性较小[6]。此外，驴奶还具有减轻氧化应激、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎和改善免疫功能等作用[7]，是适合老年人的营养乳品。

目前已证实乳清蛋白水解物能够清除自由基[8]，延缓机体衰老，但驴乳清粉水解物对衰老的研究未见报道。因此，本实验采用驴乳清粉水解物连续干预D-半乳糖衰老小鼠6周，监测其体重、血清中SOD活性和MDA含量、跳台实验、负重游泳等指标，探究驴乳清粉水解物改善D-半乳糖衰老小鼠机体衰老的相关机制，为驴乳高附加产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雌性昆明小鼠，由兰州大学基础医学院医学实验中心提供；丙二醛（MDA）试剂盒和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司；D-半乳糖和VC，购自大连美仑生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温水浴锅、DT-200小鼠跳台测试仪、游泳箱（50 cm×40 cm×60 cm有机玻璃槽）。

1.3 方法

1.3.1 驴乳清粉水解物的制备 称取0.5 g驴乳清粉，用蒸馏水配成30 mg/L的底物浓度，90℃预处理5 min，降温至最适温度，调节pH值到酶的最适值。在酶最适宜的反应温度下用恒温磁力搅拌并称取适量蛋白酶放在溶液中。反应进行时，依据所测结果加入1 mol/L的NaOH溶液或HCI溶液进行修正，保证pH值的恒定在到达预定时间调整至7.0左右。水解终止后进行水浴灭酶（水浴条件为100℃），9 000 r/min，离心10 min，倒掉上清液，剩下即为驴乳清粉水解物。

1.3.2 水解度DH的测定 根据pH-stat法（Alder-Nissen[9]，1986）测定驴乳清粉水解率。

1.3.3 衰老模型的制备 选取25～30 g健康成年雌性小鼠65只，正常对照组（12只）不做任何干预，其余小鼠颈背部注射0.25 ml/20 g体重的10%D-半乳糖生理盐水，每日1次，连续注射42 d，用来制备D-半乳糖衰老小鼠。

1.3.4 实验分组 衰老模型制作成功后，小鼠先进行4 d的适应性游泳训练，按照表1分组。腹腔注射标准为每只小鼠每天注射0.25 ml/20 g体重的10%D-半乳糖。

表1 驴乳清粉水解物干预衰老小鼠实验分组

1.3.5 负重游泳 采用50 cm×40 cm×60 cm有机玻璃槽，水深约35 cm，水温25±0.5℃。置小鼠在游泳箱中游泳（每周1次），鼠尾根部负荷5%体重的铅皮，并做好标记，记录小鼠游泳情况，至小鼠力竭时间（即小鼠从入水游泳开始记录时间至口鼻没入水中8 s，无抬头）。力竭后立即将小鼠用吹风机吹干，置于笼中正常饲喂。

1.3.6 跳台实验 在跳台训练时先将小鼠置于跳台测试箱内3 min，保证小鼠适应环境，然后通入36 V电流，在小鼠受电击后，其正常反应是跳到安全平台以躲避电击[10]。记录10 min内小鼠跳下逃避台的次数并进行统计与分析。

1.3.7 指标检测 用驴乳清粉水解物干预1～6周，检测体重；参考Farhangi等[11]方法，计算体重增长率。6周后对小鼠采血，在4℃冰箱中静置2 h，再用离心机离心，3 500 r/min，15 min。按照说明书步骤检测血清中SOD活力和MDA含量。

2 结果

2.1 驴乳清粉水解物水解率

经分析计算，驴乳清粉水解率为9.9%。

2.2 驴乳清粉水解物对D-半乳糖衰老小鼠体重的影响

由图1可知，NS-N、DWPPL、DWPPM和VC组，体重增长率与干预时间均呈正相关，且NS-N组增长率最高，DWPPL、DWPPM和VC组3组体重增长率相似，均与NS组有统计学意义。DWPPH组与NS组的体重增长率均呈下降趋势。

图1 不同剂量驴乳清粉水解物干预D-半乳糖衰老小鼠体重增长率的变化

2.3 小鼠血清抗氧化活性的变化

由图2可知，NS与NS-N相比，血清中SOD活力值下降，而MDA的含量却明显上升，具有统计学差异。驴乳清粉水解物和VC干预后，NS与乳清粉水解物低、中、高剂量组相比，MDA含量明显下降，SOD活力显著上升，且低、中剂量组与VC组结果相近，仅高剂量组MDA含量与NS组无统计学差异。

图2 小鼠血清中SOD活力MDA的含量变化

2.4 小鼠跳台实验

小鼠跳台实验属一次性刺激回避反应实验，是间接反映机体学习记忆能力的行为学方法。由表2可知，D-半乳糖造模后，衰老小鼠跳台实验潜伏期均明显下降，与正常对照组有统计学差异；随着驴乳清水解物干预时间的延长，DWPPL和DWPPM潜伏期较干预前明显延长，DWPPH组与衰老组间无明显变化。0周、3周、6周错误次数组间均无统计学差异。

表2 驴乳清粉水解物干预衰老小鼠跳台实验结果

2.5 负重游泳

由表3可知，衰老模型建成后，游泳时间均有所下降，与正常对照组有统计学差异；随着低、中浓度驴乳清水解物的逐渐干预，游泳时间延长且与衰老组均有统计学差异。但高浓度组游泳时间无变化，表明高浓度水解物对小鼠抗氧化能力效果不明显。

表3 驴乳清粉水解物干预衰老小鼠负重游泳实验结果

3 讨论

大量研究发现，随着年龄的增长，体重会逐渐下降，同样肥胖的人更容易衰老[12]。本实验中D-半乳糖衰老小鼠随干预时间的延长，体重明显下降，而低、中浓度驴乳清水解物和VC均能逆转衰老导致的体重下降。

Denham Harman认为衰老过程中细胞功能的改变是由ROS的积累导致生物分子氧化和细胞损伤。血清内SOD的活力是机体清除自由基能力的体现，同时MDA含量是机体脂质过氧化物的重要显现，SOD活力和MDA含量与氧化应激和衰老密切相关[13,14]。本实验中，衰老组的小鼠MDA含量较正常组升高，而SOD活性则降低，但在添加低、中浓度驴乳清粉水解物后MDA含量明显下降，SOD活性升高，且与VC阳性对照组结果无显著差异，说明低、中浓度驴乳清粉水解物在机体内具有抗氧化活性，可以减轻衰老导致的氧化应激。

小鼠跳台实验结果表明，D-半乳糖衰老小鼠潜伏期明显下降，随着驴乳清水解物干预时间的延长，DWPPL和DWPPM潜伏期较干预前明显延长，0周、3周、6周时，10 min内小鼠出现错误次数正常组较其他组少，组间均无统计学差异。表明D-半乳糖可通过半乳糖醇在细胞内堆积，提高机体氧化应激，引起细胞出现功能障碍，学习记忆能力下降；而干预VC和低、中浓度驴乳清水解物能降低氧化应激，进而恢复部分学习记忆能力。

中枢疲劳理论认为，耐力运动过程中，在肌糖原和肝糖原大量消耗的同时，血液中的支链氨基酸也随之降低，但游离色氨酸水平升高，大量色氨酸进入脑屏障转变为5-羟色胺，其可抑制中枢兴奋性，从而产生嗜睡和疲劳的感觉。本实验中，衰老小鼠的负重游泳时间较正常对照组明显下降，随着低、中浓度驴乳清水解物的逐渐干预，游泳时间延长且与衰老组均有统计学差异。证明低、中浓度驴乳清水解物在机体内具有较好的抗疲劳作用。其可能机制是驴乳清水解物中乳清蛋白水解肽能在机体中更快地参与肌肉合成过程，同时乳清蛋白含有支链氨基酸，可以阻断色氨酸的转运，在延缓疲劳的同时，支链氨基酸阻止肌肉分解，促进肌肉合成，对于修复运动损伤具有重要作用。

高浓度驴乳清粉水解物在体重增长率、跳台实验和负重游泳等实验结果与衰老组相比无差异，虽能降低衰老过程中的MDA含量，提高SOD活性，但仍与衰老组无统计学意义。造成这一结果的可能原因是大量氨基酸代谢脱氨，形成过量尿素在体内堆积导致机体肾损伤，进而与低、中浓度产生差异，具体损伤机制仍需进一步研究。本试验结果表明驴乳清水解物低、中浓度在机体内具有较好的抗氧化、抗疲劳和提高记忆力的作用。