新疆地区A型产气荚膜梭菌α毒素蛋白的原核表达

苏 燕，苏 艳

（1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆医科大学第八附属医院，新疆 乌鲁木齐 830052）

产气荚膜梭菌是主要分布于人畜粪便及肠道中的一类厌氧的条件性致病菌，最早称为魏氏梭菌，该菌在分解动物组织的糖分时会产生大量气体，且绝大部分菌株在生长过程中都有荚膜形成，因而称之为产气荚膜梭菌[1]。产气荚膜梭菌在世界各地都有存在，给全球养殖业的发展带来了严重影响[2]。其致病性主要来源于产气荚膜梭菌分泌的毒素，不同毒素的致病机制不同，在众多外毒素中α、β、ε和ι是最主要的[3]，这4种外毒素会对机体产生严重的毒害作用，威胁着人和动物的健康[4,5]。现阶段将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E、F、G7个细菌型[6]，其中A型和C型对人的致病性极强[7]。所有的产气荚膜梭菌都分泌α毒素，A型菌分泌的α毒素量最大[8]。研究新疆地区产气荚膜梭菌α毒素蛋白对该区域产气荚膜梭菌病的流行以及防治具有指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

质粒pET-30a载体（实验室保存），商品化的感受态，质粒和基因组提取试剂盒、快切酶、T4快速连接酶，过硫酸铵、丙烯酰胺、青霉素、还原性谷胱甘肽、诱导剂（IPTG）、低温离心机等。

1.2 设计引物

在NCBI网址中下载编码α毒素基因序列，并去掉信号肽片段，该基因共计927 bp，设计α毒素基因的引物，将设计好的基因引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，引物序列如表1所示，引物稀释后冻存。

表1 产气荚膜梭菌α毒素基因引物序列

1.3 扩增α毒素基因

用培养24 h后的A型产气荚膜梭菌提取基因组，并以此为模板，用1.2合成的引物PCR扩增α毒素基因，将扩增产物加至1.2%琼脂糖凝胶孔中，待电泳结束后回收α毒素基因片段。

1.4 重组质粒的构建

用快切酶EcolⅠ和SalⅠ双酶切α毒素基因与pET-30a载体，于37℃水浴锅中酶切20 min后回收酶切产物，酶切后的α毒素基因和pET-30a载体用连接酶过夜连接，次日转入E.coliDH5α中，将感受态复苏后用固体培养基培养，之后选单菌落在液体培养基中扩大培养，并以菌液为模板PCR扩增验证，随后提取质粒进行双酶切鉴定并送至公司测序。

1.5 α毒素蛋白的诱导表达

将鉴定正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21中过夜培养，次日扩大培养后保存菌液。选取9个高压灭菌过的摇菌瓶，每个加入200 ml含有抗生素的培养基和2 ml的菌液培养，待菌液OD600值达到0.4～0.8时，将诱导试验分为3组，第一组为16℃过夜诱导，第二组为28℃过夜诱导，第三组为37℃诱导5 h。每组设置IPTG的浓度分别为0.25 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L。收集诱导后的菌液至离心瓶中，低温重复离心清洗黏附在菌体表面的培养基，用Lysis equilibration buffer（LE Buffer）悬起菌体后进行超声破碎，设置破碎仪工作2 s、暂停5 s，超声至菌液清亮、透明为宜，约需1.5 h。破碎结束后以上述同等条件离心，分别取40 μl上清液和沉淀各加入蛋白上样缓冲液10 μl煮沸后点样至SDS-PAGE蛋白凝胶孔中，设置电泳仪的工作电压为200 V，约工作45 min。用考马斯亮蓝染色、脱色后分析α毒素重组蛋白的表达水平。

1.6 重组蛋白的纯化、浓缩

用LE Buffer平衡His-Tag Ni柱3～4次，将超声破碎后的可溶性上清蛋白加入Ni柱，并将流出液反复加入Ni柱3～4次，使得重组蛋白与Ni柱充分结合。分别用LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM、130 mM、250 mM咪唑LE Buffer进行洗脱。LE Buffer、30 mM、50 mM、70 mM、90 mM咪唑清洗4个柱体积并收集最后流出的2 ml液体，130 mM、250 mM咪唑清洗并回收1个柱体积约为10 ml的清洗液，平衡、挂柱和清洗均采取约20滴/min的流速。分别取流穿液、LE Buffer和各个浓度的咪唑清洗液，用1.5中条件进行电泳分析纯化条件和纯化后的纯度。

将纯化后的重组蛋白转入用EDTA-钠和EDTA煮沸处理过的透析袋中，透析袋长约10 cm为宜，将透析袋放置于0.01 mmol/L的PBS溶液中进行透析，PBS的体积约是重组蛋白体积的100倍。透析完成后将透析袋置于PEG 8 000中，以有效地吸出重组蛋白中的水分，达到浓缩的目的。

1.7 α毒素蛋白的Western-Blot分析

按照1.5中条件进行电泳，将蛋白胶置于半干转膜仪中的PVDF膜上并用滤纸包裹，设置转膜仪电压为15 V，待工作40 min后将PVDF膜转移至5%的脱脂奶粉中过夜封闭，次日用TBST清洗3～4次后，用酶标记的鼠抗组氨酸抗体室温孵育1 h。同样用TBST清洗3～4次，每次5～8 min，最后显色后曝光。

2 结果

2.1 α表达载体的构建

琼脂糖凝胶电泳显示，PCR扩增的基因条带约1 194 bp，与预期值相符（图1）。把此基因插入pET-30a载体后转至E.coliDH5α感受态后扩大培养进行菌液PCR验证（图2）。提取质粒双酶切检验（图3），最后将测序合适的质粒转入BL21（DE3）感受态中。

图1 PCR扩增α基因

图2 重组质粒PCR鉴定

图3 双酶切鉴定

2.2 诱导条件优化

在16℃、28℃过夜诱导和37℃诱导5 h条件下，用0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L的IPTG筛选最佳的α毒素蛋白表达条件，结果表明IPTG的浓度为0.5 mmol/L时，采用37℃诱导5 h的表达条件，最有利于重组蛋白的表达（图4）。

图4 优化诱导表达条件

2.3 重组蛋白的纯化

SDS-PAGE电泳检测流穿液和各个浓度梯度的咪唑洗脱液，结果显示90 mM咪唑LE Buffer中含有较多的杂蛋白，但130 mM咪唑LE Buffer中几乎没有杂蛋白的存在，筛选出了90 mM咪唑LE Buffer能与杂蛋白很好地结合，达到清洗的目的，用250 mM咪唑LE Buffer可与α重组蛋白结合后达到洗脱的目的（图5）。将含有重组蛋白的250 mM咪唑的洗脱液装入透析袋后置于PBS中透析，用PEG 8 000浓缩后于-80℃冻存。

图5 优化纯化条件

2.4 重组蛋白免疫原性检测

重组蛋白经12% SDS-PAGE电泳后采用半干转模仪将蛋白转至PVDF膜后进行免疫印迹反应，其结果显示约58 kD处存在特异性条带（图6）。

图6 α毒素蛋白的免疫印迹反应

3 讨论

产气荚膜梭菌病一般是多种菌型的梭菌混合感染致使动物患病，无特别有效的治疗措施，抗生素治疗效果不明显，病死率较大[9]。产气荚膜梭菌所产生的α毒素是一种多功能金属酶，该酶属于致死性毒素，能够水解细胞膜的磷脂双分子，破坏细胞膜的完整性，从而导致细胞裂解，使机体发病[10]。α毒素的启动子可被大肠杆菌的聚合酶所识别从而启动该毒素基因的转录翻译，因此本试验选择了原核表达载体pET30a和大肠杆菌表达系统，该蛋白的生产工艺成熟，且具有成本低、周期短的优点。目前，对α毒素感染尚无有效的治疗方法，免疫接种是预防该病的唯一途径。由于该菌可寄生在肠道内，属于条件性致病菌，且该菌的致病过程是其分泌的毒素发挥作用。因此，单纯地在机体中检测该菌，不能说明是产气荚膜梭菌病，在机体中检测到相应的毒素即可确诊。本试验成功诱导表达了α毒素蛋白并对其进行了纯化，获得了高纯度、高浓度且具有生物学活性的α毒素蛋白，为地区性的产气荚膜疫苗研发和进一步研制本地区α抗体ELISA试剂盒奠定了基础。