耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1在CRE中的流行病学分析及其机制研究*

陈丹丹 陈宏斌 吴敏校 邱杰 汤晓义 吴海英

（福建医科大学附属闽东医院检验科 福安355000）

肺炎克雷伯杆菌是医院感染的重要病原菌，近年来该菌阳性率不断增高，且耐药率有逐年上升趋势，甚至出现了耐碳氢酶烯类药物的肺炎克雷伯杆菌。耐碳氢酶烯类药物的肠杆菌科细菌，我们称之为CRE（Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae），表现为多重耐药。在医院常见获得性感染的革兰阴性杆菌分离培养中肺炎克雷伯杆菌阳性率居前三，且出现了高毒力的肺炎克雷伯杆菌，易导致患者出现严重的内源性感染。在耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯杆菌中检测出耐消毒剂基因，且携带率极高。耐消毒剂qacEΔl-sull基因极高的检出率表明肠杆菌科细菌（肺炎克雷伯杆菌）对医院常用消毒剂的抵抗性增高，且多出现在重症监护病房中，作为监护重点，对消毒剂的规范使用监督迫在眉睫，从而避免造成耐消毒剂基因在医院局部流行。本研究观察qacEΔl-sull基因在耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯杆菌中的流行情况，以期为医院感染的有效控制提供指导。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2019年1月~2020年12月我院重症监护室住院患者的痰液标本或肺泡灌洗液，进行细菌培养和药敏鉴定。

1.2 菌株鉴定 首先对标本进行细菌培养，挑选菌落进行鉴定，通过Vitek-2 Compact全自动细菌鉴定系统和药敏系统对送检标本进行检测，选出对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌，共选取15株菌株。质控菌株为肺炎克雷伯杆菌，标准菌株编号：ATCC700603，来自于卫生部临床检验中心。

1.3 聚合酶链反应（PCR）法检测耐消毒剂基因qacEΔl-sull

1.3.1 细菌基因组DNA提取 用无菌接种环挑取培养的单个阳性菌落（碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌），在1.5 ml的离心管内加入200 μl灭菌蒸馏水，放入挑取的菌株并振荡混匀，混匀后80℃金属浴10 min。金属浴结束后，于室温条件下，8 000 r/min高速离心10 min后弃掉沉淀物，取上清液即为模板，装入EP管中于-20℃保存备用。

1.3.2 qacEΔl-sull基因检测 对耐消毒剂基因qacEΔl-sull应用PCR法检测，PCR扩增产物大小为300 bp，引物，F：5'-TAGCGAGGGCTTTACCTAAG C-3'；R：5'-ATTCAGAAATGCCGAACACCG-3'[1]。50 μl的PCR反应体系包括10×PCR缓冲液1 μl，引物1和引物2各2 μl，dNTP为4 μl，Taq DNA聚合酶25 μl，DNA模板4 μl，加双蒸水16 μl至50 μl。94℃预变性2 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共30个循环，72℃延伸5 min。

1.3.3 电泳 取扩增后的PCR产物5 μl于1.2%琼脂糖凝胶电泳。

1.3.4 基因测序 将扩增阳性的PCR产物片段低温-20℃保存，寄至福州锐栢生物技术有限公司进行基因测序，并将阳性扩增基因测序结果在GenBank上进行BLAST比对。

2 结果

2.1 扩增产物电泳图拍照 见图1。

图1 扩增产物电泳图

2.2 基因测序结果 将qacEΔl-sul1扩增阳性产物的基因测序结果（见图2）放至NCBI网站（http：//blast.Ncbi.nlm.Nih.gov/Blast.cgi）上进行比对。基因测序结果：CCGGGTTTATGGGCATCGCATTTTAT TTTCTTTCTCTGGTTCTGAAATCCATCCCTGTC GGTGTTGCTTATGCAGTCTGGTCGGGACTCGG CGTCGTCATAATTACAGCCATTGCCTGGTTGCT TCATGGGCAAAAGCTTGATGCGTGGGGCTTTG TAGGTATGGGGCTCATAATTGCTGCCTTTTTGC TCGCCCGATCCCCATCGTGGAAGTCGCTGCGG AGGCCGACGCCATGGTGACGGTGTTCGGCATT CTGAAT。15株耐碳氢酶烯肺炎克雷伯杆菌检测出14株菌株携带有qacEΔl-sull基因，检出率为93%（14/15）。

图2 耐消毒剂基因qacE△1序列

3 讨论

在重症监护病房分离出的肺炎克雷伯杆菌是造成医院感染的主要细菌之一，可引起全身各系统的严重反应[2~3]。临床数据表明，由于重症监护室病人大量使用碳青酶烯类药物，乃至过度治疗，在痰液中分离到的耐碳青酶烯类药物肺炎克雷伯杆菌越来越多[4~5]。高毒力肺炎克雷伯菌，特别是耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌逐渐成为血液感染者和肝脓肿患者的主要病原菌[6]。耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的毒力较强，不仅易出现医院获得性感染，而且容易导致年轻健康的个体获病[7]，病人的死亡率高，并且引起很严重的内源性感染和并发症。随着多重耐药菌的广泛出现，消毒剂的使用在医院感染管理中有着重要的地位。然而在消毒剂使用过程中，难免出现消毒剂浓度过高或消毒剂滥用的情况，势必导致耐消毒剂基因菌株出现。当消毒剂使用过程中长期处于消毒时间或浓度不足，将会筛选出对消毒剂耐药的细菌[8]。

在本研究中，选取重症监护病房中重症患者的痰液或肺泡灌洗液中的耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯杆菌，参考相关文献，设计耐消毒剂基因的引物，引物为F：5'-TAGCGAGGGCTTTACCTAAGC-3'；R：5'-ATTCAGAAATGCCGAACACCG-3'，PCR扩增后出现阳性产物，经基因测序比对后为qacEΔl-sull基因。15株耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯杆菌中有14株携带该基因，剩余1株未扩增出qacEΔl-sul1基因。阴性结果分析可能为这一株耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯杆菌的qacEΔl-sul1基因突变或基因缺失，或者可能为实验条件不合适所造成。

参考相关文献，分析该菌耐消毒剂的原因[9~10]：细菌对消毒剂产生耐药性的主要原因是选择性压力，尤其是在亚致死剂量消毒剂的使用下，或是在消毒剂滥用的情况下，细菌为适应不断变化的消毒剂浓度环境，进而对消毒剂产生耐受。临床上经常使用的消毒剂有碘伏、巴氏消毒液、533（含氯消毒剂）、爱护佳（含葡萄糖酸氯己定）、洗必泰、苯扎氯铵等。然而由于各种消毒剂在被广泛而不尽合理地使用，从而对细菌造成选择性压力，产生对消毒剂不敏感或常规使用消毒剂浓度下不能杀灭细菌。因此我们在临床消毒时，要不定期更换消毒剂，最大限度地降低细菌对消毒剂耐受。另外由于细菌长期暴露于日渐增高的消毒剂环境中，细菌对消毒剂的环境产生耐受。细菌耐消毒剂还有一个原因主要是qac基因家族表达多种化合物外排系统，细菌获得qac基因后家族表达多种化合物外排泵，已发现的有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacEΔ1，表现为对胍类化合物、季铵类、腙类化合物及碱性染料等的抗性[11]。耐消毒剂qacEΔ1基因编码季铵盐类、胍类化合物等消毒剂的外排蛋白，和sul1基因叠加，引起细菌对磺胺类抗生素的耐药。由Ⅰ类整合子介导的qac基因家族中qacEΔ1基因，可被革兰阴性菌（肺炎克雷伯杆菌）广泛获取[12~13]。

本研究收集的是重症监护室耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯杆菌，株数较少，只有15株，但耐消毒剂qacEΔl-sul1基因的携带率极高（93%）。此研究还有一定的局限性，未必能准确反映耐消毒剂qacEΔl-sul1基因的整体携带情况，但仍能反映出此类细菌对日常消毒剂的抗性。在某儿童医院PICU[14]报告中，由于医护人员手卫生消毒不当和消毒剂不合理使用，导致耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌在PICU局部流行。耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌的毒性强，对病人造成的危害大，特别是抵抗力弱，年龄低下或高龄的患者，带来的危害最大。该菌不仅存在于重症监护病房，也存在于儿童或是其他不同病房，因此在治疗其他病人时也需警惕该菌的出现，防止出现医院的局部爆发流行，对病人造成不必要的危害。耐碳青霉烯类药物肺炎克雷伯菌不仅来自病人本身，还容易存活于医院其他物体表面，例如医护人员的手、工作服以及病人的周围环境。因此我们在为病人使用抗生素治疗的同时，必须注意该菌的消毒剂抗菌现象，防止多种耐药菌群的交叉感染。根据细菌耐药检测报告，肺炎克雷伯杆菌的耐药性在逐年递增，对消毒剂的抗药性也在逐年递增，因此我们在合理规范使用抗生素的同时，应格外关注细菌对消毒剂产生的抗性现象，降低细菌对消毒剂的抗药性，对医院环境进行综合治理。

综上所述，细菌耐药性的分布和传播是受多方面因素影响和制约的，耐消毒剂基因的出现是不可避免的，也是不可预知的。临床工作者要充分了解耐消毒剂基因的特征和现状，建立健全的临床消毒剂使用规范，减少因不规范使用或滥用消毒剂而导致的耐消毒剂基因的传播。