不同抑菌剂在铁皮石斛开放组培中抑菌效果比较研究

王 娟,朱小东,常 玮

(南阳师范学院 生命科学与农业工程学院，河南 南阳 473061)

0 引言

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是兰科石斛属多年生草本植物，是一种兼具观赏价值及养生保健功能的珍稀中药材[1-2].自古以来，铁皮石斛就有“救命仙草”的美誉.野生铁皮石斛日渐稀少，根据《中国植物红皮书》中的分类，属濒危种[3].为了满足市场的需求和最大限度地保护野生石斛资源，生产上通常采用植物组织培养技术(Plant tissue culture)来进行石斛种苗的快速繁殖.近年来，研究人员对石斛组培技术进行了大量的研究，使其生产工艺日臻完善.例如，朱艳等比较不同的培养基、激素等因素对茎段分化丛生芽的影响，同时研究了香蕉汁和活性炭对试管苗生根的影响[4].何俊平等也进行了相似的研究，最后得出铁皮石斛生根最适宜培养基为1/2MS+0.2 mg/L NAA+1 g/L活性炭+10%香蕉泥[5].另通过筛选培养基[6-9]，调整pH值[10]和添加激素[6，11-12]等措施优化培养条件，使铁皮石斛的工厂化育苗和规模化栽培不断取得突破，极大地推动了铁皮石斛产业的发展[13].然而常规组培生产需要灭菌锅、超净台等设备来保证组培苗在无菌的环境中生长，前期投入较大，限制了其生产规模.一些研究人员提出了通过在培养基中添加抑菌剂而不经过高温灭菌，同时在普通环境下进行接种的组培方式，即开放组培技术[14].相对于传统的组织培养而言，开放式组培前期投入较少，对环境的要求粗放，操作简便，非常适合中小型种苗基地进行组培生产.

迄今为止，基于不同抑菌剂的开放组培技术，已在多种植物中成功应用.其中，抑菌剂的使用是开放式组织培养的关键步骤.常用的抑菌剂包括具有抗菌作用的中药活性成分、化学农药、农用抗生素、氧化剂以及由不同抗菌成分组成的复合型抑菌剂.这几种抑菌剂已在葡萄[15]、菊花[16]、长柄扁桃[17]、甘蔗[18]、半夏[19]、东北红豆杉[20]、白菜[21]等植物中成功应用.尽管如此，若要将开放组培技术应用到实际生产中，作为技术核心的抑菌剂应该同时具备长效抑菌效果、对植物伤害小及成本低等特点.只有同时具备上述特点的抑菌剂才适合基于开放组培技术的铁皮石斛工厂化育苗，而氧化剂、化学农药等对植物伤害较大；抗生素易产生耐药性；中药活性成分的生产成本较高.

近年来，随着人们对开放组培的深入研究，已经有多种长效、广谱、高活性、对植物友好的新型植物组织培养专用防污染杀菌剂被研发出来，如植培灵、清菌易等.本研究拟以铁皮石斛无菌组培苗为材料，采用开放组培的方式，通过在铁皮石斛增殖培养过程中添加不同类型的抑菌剂来比较不同抑菌剂在开放组培中的应用效果，从而选择最适宜进行开放组培的抑菌剂.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

本实验所用的植物材料为软脚铁皮石斛无菌苗，由南阳卉农植物组培生物科技有限公司提供.

1.1.2 实验试剂

大量元素：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O；

微量元素：MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O；

铁盐：FeSO4·7H2O、EDTA；

有机物：肌醇、烟酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸；

生长调节物质母液：NAA、6-BA;

抑菌剂及其他：植培灵(上海宇涵生物科技有限公司生产，使用体积分数是2.5 mL/L)、清菌易(北京康倍斯/格林善德科技有限公司生产，使用体积分数是2 mL/L)和农用链霉素(重庆恒丰生物科技发展有限公司生产，使用质量浓度是0.3 g/L)、蔗糖、琼脂、HCl、NaOH.

1.1.3 实验器材

本研究涉及的器材包括：超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱.

1.2 实验方法

1.2.1 培养基母液配制

本研究所用基础培养基为MS培养基，母液配制采用混配法，分别按照表1中所列试剂及其所需剂量进行大量元素、微量元素及有机物母液配制(表1).

表1 MS培养基母液配制 单位：mg/L

铁盐母液配制：按表2称量FeSO4·7H2O和EDTA，在配制时，分别在加热状态下将两种试剂溶解，最终将FeSO4溶液缓慢倒入EDTA溶液中，加蒸馏水定容至1000 mL，低温避光保存.

表2 200×铁盐母液配制

NAA母液的质量浓度为1 mg/mL，配制时先用少量95%的乙醇将100 mg NAA溶解，再溶于90 mL蒸馏水中，最终用蒸馏水定容至100 mL，贮藏于棕色试剂瓶中，贴好标签放入冰箱内低温保存.

6-BA母液的质量浓度为1 mg/mL，配制时先用少量浓度为1 mol/L的HCl将100 mg 6-BA溶解，再溶于90 mL蒸馏水中，最终定容至100 mL，贮藏于棕色试剂瓶中，贴好标签放入冰箱内低温保存.

1.2.2 实验设计

本研究所用培养基为铁皮石斛不定芽诱导培养基(培养基A)，主要成分为：MS+2.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂.在此基础上分别添加不同类型的抑菌剂及抑菌剂组合，以此作为实验处理组，实验设计如表3所示，每个处理接种10瓶.所有培养基的pH值控制在5.6～5.8.

表3 实验设计方案

1.2.3 接种及培养

开放组培的标准接种步骤为：在接种工作开始之前，先用75%的医用酒精对接种室进行降尘处理；喷洒均匀后打开紫外灯或臭氧机进行室内消毒，同时用75%的医用酒精擦拭简易工作台并打开紫外灯、关闭透明防护隔板，时间为30 min；接种人员进入接种室前应穿好工作服，戴帽子、口罩，并将手洗干净；进入接种室后将门关闭，接种期间不要随意走动，减少空气流动；关闭室内紫外灯及简易工作紫外灯；双手经75%医用酒精消毒后在简易台内进行接种，接种方法与常规组培无菌操作技术相同.

为了在实验室内模拟开放组培的操作环境，本研究在接种前按照开放组培的操作规程进行室内消毒，同时在使用超净工作台进行接种时将风机关闭，以此模拟简易工作台的接种环境.消毒结束后按无菌操作步骤进行接种操作，每个处理接种10瓶，每瓶接种铁皮石斛无菌苗5株，3次重复.接种后放于光照培养箱内培养(环境温度：25 ℃；湿度60%；光周期：昼夜长均为12 h).

1.2.4 数据统计

接种30 d后统计各处理及对照组培苗的生长状况、污染情况和增殖情况.

生长状况以成活率表示：成活率=(成活苗数/外植体数)×100%；

污染情况以污染率表示：污染率=(污染瓶数/接种瓶数)×100%；

增殖情况以增殖系数表示：增殖系数=不定芽数/外植体数.

数据统计、描述统计、方差分析及相关图表的制作采用Excel 2007中进行.

1.2.5 抑菌剂应用潜力分析

为了对本研究使用的几种抑菌剂的应用潜力进行比较，分别以成活率、污染率、增殖系数及商品价格为参数，采用加权累积法来计算不同抑菌剂的分值，并通过分值的大小来评价其应用潜力.每个参数的权重及评价标准如表4所示.

表4 抑菌剂应用潜力评价体系

2 实验结果

2.1 生长状况比较

为了比较不同抑菌剂对石斛生长的影响，培养30 d后统计各处理及对照的成活率，结果如表5所示：T1的平均成活率最高为100%，T2为70%，T3为92%，T4的平均成活率最低为22%.方差分析结果表明，T1与CK1之间差异不显著，表明单独添加植培灵对石斛生长状况无明显不良影响；Duncan’s新复极差法多重比较结果显示，4个处理组两两之间均存在显著差异，表明清菌易、农用链霉素均对石斛的生长有一定影响(表5).

表5 不同处理成活率多重比较结果

2.2 污染情况比较

为了比较不同抑菌剂的抑菌效果，培养30 d后统计各处理及对照的污染率情况.经计算，T1、T2、T3及CK1的3次重复均未发生污染，污染率为0.00%；CK2的污染率最高，为100.00%；T4处理3次重复的平均污染率为10.00%.多重比较结果表明，T4与T1、T2、T3及CK1之间差异不显著(P=0.158)，而与CK2存在极显著差异(P<0.01).

2.3 增殖情况比较

培养60 d后统计各处理及对照的增殖情况，并计算相应的增殖率，结果如表6所示：T1为2.32，T2为0.92，T3为1.96，T4为0.4.多重比较结果表明：T1与T3之间差异不显著，但同时与CK1之间存在显著差异，这说明添加植培灵还会促进不定芽增殖，同时也表明，在添加有植培灵的培养基中添加链霉素不会对不定芽的增殖产生不良影响.T2和T4这两个处理与其他两个处理及对照之间存在显著差异，表明单独添加清菌易会影响不定芽的增殖，而清菌易+链霉素的组合则会加剧这种不良影响(表6).

表6 不同处理增殖系数多重比较结果

2.4 抑菌剂应用效果比较

根据不同处理的成活率、污染率、增殖情况及商品单价计算相应处理的分值，并以此作为其应用潜力的依据，例如T1的分值Score_of_T1=0.35×3+0.35×3+0.2×2.32+0.1×1=2.664.同理可得T2、T3、T4的分值分别为2.134、2.592、和1.680.由上述结果可知：当培养基单独添加0.25%的植培灵时，应用效果最好.

3 讨论

3.1 抑菌效果比较

开放组培的关键是高效广谱性抑菌剂的选择及其适宜浓度的筛选.多菌灵[17]、大蒜素[21]、链霉素[22]、代森锰锌[23]、次氯酸钠[24]和山梨酸钾[25]等作为植物开放式组织培养抑菌剂的应用研究已有诸多报道.近年来发现：乙醇提取物[26]、总黄酮[27]、植物精油[28-29]和植物源抑菌剂[30]等也具有较好抗菌活性.在进行选择时，首先要考虑的是其抑菌效果，然后再在此基础上选择对植物伤害最小的抑菌剂.本实验的4个处理在抑菌效果方面(污染率分别为0.00%、0.00%、0.00%、10%)均与CK2(污染率为100.00%)具有显著差异，因此均可作为候选抑菌剂应用到开放组培中.王淑杰等选用4种不同抑菌剂进行东北红豆杉开放组培，证明质量浓度为0.4 g/L的农用链霉素抑菌效果最好，这与本研究的结果一致[20].

3.2 对生长发育影响比较

尽管很多抑菌剂的抑菌效果很显著，但一些种类也会对植物的生长发育产生影响.例如，李晓燕的研究表明：菌杀保果、1229消毒剂和硫酸庆大霉素对供试植物材料均表现出一定的毒性，且表现出剂量效应[31].Mikami等研究表明：当链霉素质量浓度为250 μg/mL时，对水稻愈伤组织的分化有明显抑制作用[32].在本研究涉及的4组处理中，与对照(CK1)相比，植培灵(T1)对石斛组培苗的生长无显著影响，而在此基础上添加链霉素后(T3)，成活率显著下降，其平均成活率为92%，说明链霉素对石斛组培苗的生长产生了影响.与对照(CK1)相比，清菌易(T2)对石斛组培苗的生长产生了极显著影响，其平均成活率为70%.在此基础上添加链霉素后(T4)，平均成活率最低为22%，表明清菌易与链霉素存在互作效应.

对增殖系数的比较也呈现出上述规律.与之不同的是培养基中添加植培灵(T1)培养30 d后，其增殖系数为对照(CK1)的1.78倍.由于不清楚其中的成分，其原理不得而知，推出其中可能含有一些能够促进细胞增殖、芽分化的物质.

3.3 应用效果比较

在采用开放组培进行工厂化育苗时，抑菌剂的价格也是其中要考虑的一个因素.本研究涉及的三种抑菌剂中，植培灵的价格最高，为1.65元/L，分别为清菌易和链霉素的4.45倍和22.25倍.然而综合考虑组培苗的成活率、增殖系数及人工成本，植培灵是性价比最高的抑菌剂，与本研究评价体系得出的结果一致.

4 结论

在本研究所采用的几种抑菌剂中，植培灵的抑菌效果最佳，同时对铁皮石斛的生长无不良影响，且还具有促进不定芽增殖的作用，可将其应用到铁皮石斛开放组培中，体积分数为2.5 mL/L.