过表达FAK对人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞增殖及侵袭的影响

陈 凯，李张维，廖晓颖，康成容，龚 攀

舌鳞状细胞癌是口腔颌面及头颈部位最常见及发病率最高的一种实体恶性肿瘤[1-2]，其具有较强的局部浸润、侵袭及颈部淋巴结转移等生物学特征。目前，现有的治疗疗效均较差[3]，患者5年生存率仅为50%～60%[4-5]。

黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)作为非受体型的酪氨酸激酶的一种类型，在正常生理状态下发挥调节细胞之间、细胞与胞外基质之间黏附作用；与整合素蛋白构成复合体后，又可在细胞生理活动的调控方面发挥作用。已有研究和实验揭示，FAK表达变化与人恶性肿瘤细胞的生长及转移关系密切。但以往文献报道大多局限于临床病理相关性的研究，尚缺乏在细胞水平对其具体功能和机制的研究。本组前期实验结果证实，下调舌鳞状细胞癌细胞中FAK的表达量，可有效影响肿瘤细胞的多项功能[6-7]。为更深入地揭示FAK在舌鳞状细胞癌细胞生长、转移过程中的作用，本实验构建了FAK基因过表达载体，培养高表达FAK的舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株，探讨FAK高表达对舌鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27由中山大学附属第二医院李劲松教授惠赠。DNA聚合酶试剂盒、Kpn I和BamH I限制性内切酶、DNA连接酶试剂盒、Lipofectamine 2000购自Themro Seientific公司；噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司；凝胶纯化试剂盒购自Qiagen公司；GoScript Reverse Transcription System购自Promega公司；GoTaq qPCR Master Mix试剂盒购自Promega公司；Trizol试剂盒购自TIANGEN公司；FAK单克隆抗体(兔抗)购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1舌鳞状细胞癌细胞的培养 筛选低转移CAL-27细胞株，在10%胎牛血清的培养基中接种培养挑选的舌鳞状细胞癌细胞至对数生长期(培养箱环境设定为37 ℃ 5%CO2)，行下一步实验。

1.2.2目的基因过表达载体的构建 通过对FAK基因序列及载体pcDNA3.1(+)序列分析，将目的片段克隆到载体中。设计并合成FAK基因的上、下游引物，引物序列如下：FAK-Kpn I-F: 5′-GGGG TACCATGGCAGCTGCTTACCTTGAC-3′(下划线为Kpn I酶切位点)，FAK-BamH I-R: 5′-CGGGATC CTCAGTGTGGTCTCGTCTGCC-3′(下划线为BamH I酶切位点)。使用Trizol试剂盒获取总RNA，经过逆转录反应提取cDNA，PCR扩增FAK序列，经过电泳、纯化、回收，Kpn I及BamH I双酶切后，回收目标序列，将目标序列连接到载体pcDNA3.1(+)中。在Trans-T1感受态细胞中加入重构的载体质粒，对菌落进行扩大培养。挑选阳性单克隆，送测序公司(广州赛哲生物公司)进行测序鉴定。

1.2.3分组和转染 按照转染试剂盒说明书，分别将pcDNA3.1(+)-FAK重组载体及pcDNA3.1(+)-NC空载体转染CAL-27细胞，选取状态最佳的细胞进一步扩增培养。实验组为pcDNA3.1(+)-FAK质粒转染细胞；阴性对照组为pcDNA3.1(+)-NC空载体转染细胞；空白对照组为野生型CAL-27细胞。

1.2.4qPCR 使用Trizol试剂，提取细胞总RNA；进行质量评估后使用GoScript Reverse Transcription System试剂盒将总RNA逆转录为cDNA；qPCR实验使用GoTaq qPCR Master Mix试剂盒，PCR仪为西安天隆TL988-IV系统。以GAPDH作为内参，采用比较CT法分析相关数据。FAK引物序列：上游5′-TTGGACGATGTATTGGAGAAGG-3′；下游5′-TTTA ATTGCAACCGCCAAAG-3′。

1.2.5Western blot法 在样品中加入裂解液，提取细胞总蛋白。调配标准蛋白液和工作液，测量570 nm吸光度值，换算蛋白浓度。配备Master Mix和Biotinylated Ladder。Master Mix与蛋白样品(稀释比1 ∶4)混合、震荡后，将各组样本和Biotinylated Ladder放入沸水5～10 min。按照Wes Separation Module试剂盒说明书要求，去除上样板封口，对样品及相关试剂进行上样操作，在此过程中需注意避免产生气泡。使用Proteinsimple Wes仪器，运行程序，获得结果。

1.2.6MTT实验 将状态良好的各组舌鳞状细胞癌细胞在96孔板中接种，设置4个时间点(0、24、48和72 h)，每个时间点为1块板。待实验细胞贴壁，更新培养液，加入MTT试剂后继续培养4 h，再加入DMSO，酶标仪测量吸光度值(492 nm波长处)。

1.2.7Transwell小室实验 接种实验细胞前，在Transwell小室上表面涂覆Matrigel溶液，加入无血清培养液，置于培养箱中平衡。对各组实验细胞进行消化、计数，制成细胞悬液，加入小室上半室；完全培养基加入小室下半室。在小室中培养20 h，弃去下半室培养液，擦除上半室内表面细胞，常温染色(0.1%无水甲醇结晶紫)。显微镜下随机抽选5个视野拍照，计数，并计算每个视野计数的平均值。

2 结果

2.1 稳定转染CAL-27细胞后各组中FAK mRNA的表达转染CAL-27细胞后实验组中FAK mRNA的相对表达量(11.15±0.23)明显高于空白对照组(1.00±0.10)和阴性对照组(0.86±0.18)，空白对照组和阴性对照组的表达值仅为实验组的8.97%和7.71%。实验组中FAK mRNA的表达显著上调，与空白、阴性对照组相比，差异有显著性(F=3 356.83，P<0.01，图1)。

图1 各组FAK mRNA的表达

2.2 稳定转染CAL-27细胞后各组中FAK蛋白表达稳定转染CAL-27细胞后，Western blot法检测实验组中FAK蛋白的相对表达量(0.136 3±0.027 9)明显高于空白对照组(0.077 7±0.013 6)和阴性对照组(0.814 2±0.010 2)。对照组表达量仅为实验组的57.0%和59.74%，实验组中FAK蛋白表达显著上调，与空白、阴性对照组相比，差异有显著性(F=8.64，P<0.05，图2、3)。

图2 各组中FAK蛋白表达变化

图3 各组中FAK蛋白表达

2.3 FAK过表达对细胞增殖能力的影响MTT实验检测发现，在0 h和24 h时，三组细胞的增殖能力差异无显著性(F0 h=4.37，P0 h>0.05；F24 h=0.212，P24 h>0.05)。在48 h和72 h时，实验组的吸光度值均明显高于空白对照组和阴性对照组，实验组细胞的增殖活性随着时间的延长而显著增强，具有时间依赖性(F48 h=6.41，P48 h<0.05；F72 h=54.40，P72 h<0.01)。FAK基因高表达能增强舌鳞状细胞癌细胞的增殖能力(图4)。

图4 各组细胞的增殖能力变化

2.4 FAK过表达对细胞侵袭能力的影响Transwell小室实验检测显示，实验组细胞穿膜至下室的数目(98.00±8.80)明显高于空白对照组(60.20±11.12)及阴性对照组(43.60±7.50)，差异有显著性(F=45.28，P<0.01)。FAK基因过表达后，舌鳞状细胞癌细胞的侵袭能力明显增强(图5)。

图5 各组细胞侵袭能力的变化：A.空白对照组；B.阴性对照组；C.实验组

3 讨论

FAK广泛分布于人体各种细胞内及细胞外基质中，参与多种细胞学行为，在涉及细胞相关信号传导的过程中发挥极其重要的作用。FAK在受到刺激后，引发黏着斑结构中靶蛋白的磷酸化，介导FAK/PI3K、FAK/Ras/MAPK及FAK/rc/p130CAS/JNK等多种信号传导通路，是细胞内外信号出入的枢纽。近年，众多实验结果亦揭示FAK参与了肿瘤的血管生成，与肿瘤细胞的生长、凋亡及侵袭等生物学行为关系密切[8]。现有研究显示，泌尿系统肿瘤、消化系统肿瘤、肺癌及子宫颈癌等多种恶性肿瘤的预后不良与FAK的过表达密切相关[9-12]。FAK在舌鳞状细胞癌中的表达亦显著增加，且高表达的FAK促进了癌细胞的侵袭和转移[13]。目前，关于FAK与舌鳞状细胞癌细胞相互作用的具体机制尚不清楚，相关报道较少，有必要在细胞水平进行深入分析。

在基因学研究中，对目标靶基因的沉默和过表达是最常用的技术和手段。其中，基因过表达技术在研究生物分子间的相互作用及相互关系方面更具优势；但由于过表达载体不易构建等原因，目前关于人FAK过表达研究方面的报道较少。本实验成功构建并获取了过表达FAK的质粒pcDNA3.1(+)，筛选合格的pcDNA3.1(+)-FAK对舌鳞状细胞癌CAL-27细胞进行转染，建立了过表达FAK的细胞模型。利用此细胞模型，研究发现FAK高表达可有效提升舌鳞状细胞癌细胞的增殖活性和侵袭能力。

肿瘤的转移包含一个复杂的病理、生理过程：癌细胞从肿瘤原发灶剥离后，汇入循环系统，再穿过血管、淋巴管管壁，到达继发位置，最后在此部位停留、长大，形成肿瘤转移灶，这其中关联了多个阶段、多条途径及多种调控机制。在此过程中，肿瘤细胞还必须具备重要的生存特性：(1)抗凋亡特性；(2)在其它组织中生存、增殖的特性。FAK作为多种信号通路中的关键调节因子，与肿瘤细胞的增殖和侵袭关系密切，其主要通过以下4条途径介导细胞的增殖和侵袭：(1)FAK/PI3K-AKT途径：一般情况下，锚着依赖性生存(anchor-dependent survival)是人体内各种组织细胞均具有的生理特性；一旦组织细胞脱离了相互的黏附、黏着状态，便易发生死亡，也称失巢凋亡。而癌细胞则恰恰具备了这种抗凋亡能力：其在脱离黏附后，能够以一种十分特殊的状态存活，为肿瘤的远处转移创造了可能性。已有研究证实，在口腔恶性肿瘤的转移过程中，癌细胞的抗失巢凋亡能力发挥了举足轻重的作用[14]。细胞生存相关的整合蛋白簇聚后，FAK发生磷酸化，刺激PI3K/AKT信号级联反应，补偿了脱黏附肿瘤细胞缺失的生存信号，使其具有脱黏附生存的能力，侵袭和转移能力也同时得到增强；另外，AKT激活后，促凋亡蛋白BAD和Caspase-9活性受到抑制，进一步增强了肿瘤细胞的抗凋亡能力[15]。(2)MAPK-ERK途径：FAK通过此信号转导通路调节多种转录因子的活化，模拟细胞生存信号，激活Paxillin蛋白的磷酸化，影响细胞骨架的重组，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[16]。(3)FAK-p53途径：p53是目前研究最成熟的一种抑癌因子，能接受多种信号刺激，影响细胞的生长周期，调控细胞老化及凋亡机制的启动，在抑制细胞的恶性转化、促进生理性及病理性的DNA损伤修复等方面发挥积极作用[17]。经由非激酶依赖途径，FAK可与p53、MDM2发生相互反应，诱导并加速p53的泛素化及降解，延缓肿瘤细胞的凋亡；此外，FAK自身携带的FERM结构域还可增强p53的活性，加速消除相关激酶类物质，促进肿瘤细胞的增殖[18]。(4)FAK-RIP途径：NF-κB是重要的促细胞存活的信号效应分子，而受体相互作用蛋白(receptor interacting protein, RIP)可以调节NF-κB的活性，在细胞生存、凋亡及器官发育、免疫应答等信号传导过程中发挥积极的作用。FAK可以与RIP结合，并激活NF-κB；当FAK高表达时，FAK与RIP的平衡关系受到破坏，诱发细胞增殖处于活跃状态，细胞凋亡受到抑制。

综上所述，本实验结果显示，FAK过表达可以通过多种复杂的信号通路有效提升舌鳞状细胞癌细胞的增殖活性和侵袭能力，促进肿瘤的生长。FAK可以为舌鳞状细胞癌患者的生存期及预后判断提供参考，对FAK进行更深入的研究不仅有利于揭示舌鳞状细胞癌的发病机制，也可能为其临床治疗提供新的方向和靶点。