胃腺癌组织中PD-L1和M2型肿瘤相关巨噬细胞的表达及临床意义

权秋颖，曹 磊，张 闽，黄 山，黄仁鹏，陈 志，郭凌川

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，发病率位居全球恶性肿瘤的第5位，病死率位居癌症死亡的第3位[1]。每年中国胃癌患者的死亡人数约占全球胃癌死亡人数的一半[2]。传统治疗如手术和放、化疗均无法明显改善患者的总生存期，5年生存率不足30%[1]。程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)作为负性共刺激分子，是B7家族的一员，其与对应的配体PD-1结合可造成T细胞失活[3-4]。PD-L1在多种肿瘤如胃癌、黑色素瘤、肺癌、结直肠癌等[5]中过表达。在很多实体肿瘤如黑色素瘤、肺癌中，抗PD-L1抑制剂表现出了良好的效果[6]，但在胃癌中，采用抗PD-L1抑制剂总体有效率不高。研究表明，肿瘤组织中PD-L1表达、肿瘤间质中浸润细胞的类型等均与患者采取抗PD-L1治疗后的效果有关[7]，因此选择适宜行免疫治疗的人群至关重要。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在免疫微环境中扮演着重要的角色，TAMs可分为M1型和M2型，其中M1型主要发挥抗肿瘤效应，M2型(因表达特异性标志物CD163，以下均用CD163表示)通过产生免疫抑制细胞因子如IL-10、TGF-β促进肿瘤进展，同时还可表达PD-L1/2，与T细胞结合产生免疫抑制作用[8-9]。一般狭义的TAMs即指发挥免疫抑制及促瘤作用的M2型TAMs。然而，PD-L1和M2型TAMs的关系仍需深入探讨。本实验通过观察PD-L1和CD163在胃腺癌组织中的表达，旨在为胃癌联合治疗提供新思路和方向。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2011年5～12月苏州大学附属第一医院存档的268例胃腺癌标本，所有标本术前均经病理确诊，患者年龄33～88岁，平均(64.5±10.8)岁。所有患者术前均未行任何放、化疗等其它治疗。通过电话随访获得患者的生存状况，随访截至2017年12月，合计198例患者获得完整的生存资料，余70例失访。

1.2 主要仪器及试剂大体显微镜(CX23)，购自日本Olympus公司，Dmetrix远程医疗图像处理系统，购自帝麦克斯苏州医疗公司，全自动多功能染色机(ST5020)，购自徕卡公司。PD-L1(克隆号SP142)、CD163(克隆号10D6)，均购自北京中杉金桥公司，免疫组化用二抗HRP标记鼠/兔通用型二抗，购自福州迈新公司。

1.3 方法采用免疫组化EnVision法检测胃腺癌癌细胞和间质细胞中PD-L1蛋白表达水平及CD163在胃腺癌间质细胞中的表达，分析两者表达与胃腺癌临床病理特征及患者预后的相关性。评判标准：所有切片均经两位有经验的病理医师采用双盲法阅片，对肿瘤细胞及肿瘤间质区域分别进行评分，计算阳性细胞百分率为阳性细胞平均数/所有视野内细胞总数×100。切片染色评分为0～3分(无阳性细胞为0分，阳性细胞数<10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分)，将评分0～1分归为低表达组，2～3分归为高表达组；根据公式计算染色定量的组织评分(3+阳性细胞百分率)×3+(2+阳性细胞百分率)×2+(1+阳性细胞百分率)×1，免疫组化评分范围从0～300不等[10]。

1.4 统计学分析采用SPSS 19软件进行统计学分析，采用χ2检验分析PD-L1和CD163蛋白表达与胃腺癌临床病理特征之间的关系，Spearman秩相关检验分析PD-L1与CD163在胃腺癌组织中表达的相关性，采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验进行预后生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃腺癌组织中PD-L1和CD163的表达及与临床病理特征的关系52例(19.4%)胃腺癌癌细胞高表达PD-L1，167例(62.3%)胃腺癌间质细胞高表达PD-L1，PD-L1和CD163表达均可定位于细胞膜和细胞质(图1)。胃腺癌间质细胞中PD-L1表达与肿瘤浸润深度(P=0.010)、肿瘤分期(P=0.043)呈负相关(P<0.05)，与患者年龄、淋巴结转移无关；胃腺癌癌细胞中PD-L1的表达与各临床病理特征均无关；CD163表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期呈正相关(P<0.05，表1)。

图1 胃腺癌组织中PD-L1和CD163的表达：

表1 胃腺癌组织中PD-L1和CD163的表达与临床病理特征的关系

2.2 胃腺癌组织中PD-L1与CD163表达的相关性相关性分析结果显示，胃腺癌癌细胞或间质细胞中PD-L1的表达与CD163表达均呈正相关(P<0.001，图2)。

图2 胃腺癌组织中PD-L1与CD163蛋白表达的相关性分析：

2.3 生存分析Kaplan-Meier生存曲线分析显示，胃腺癌癌细胞中PD-L1的表达与患者生存无相关性(图3A)；胃腺癌间质细胞中PD-L1的表达越高，患者预后越好(P=0.028，图3B)；CD163表达与患者生存无关(图3C)。

图3 Kaplan-Meier生存曲线分析：

2.4 联合检测PD-L1与CD163的表达与胃腺癌患者预后的关系胃腺癌癌细胞或间质细胞中PD-L1高表达同时CD163低表达时患者预后最佳，PD-L1低表达同时CD163高表达时患者预后最差，差异有统计学意义(图4)。

图4 PD-L1和CD163联合检测与胃腺癌患者的预后分析：

3 讨论

既往报道表明，通过靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体在黑色素瘤、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗中起到了令人瞩目的效果，然而，其在胃癌中的疗效仍未有明确定论，PD-L1在胃癌组织中的表达及与患者预后的关系仍有争议，其调控机制需要进一步探讨[11]。TAMs在促进肿瘤增殖、新生血管形成和转移中扮演重要角色，TAMs还可表达PD-L1/2，与PD-1结合从而抑制T细胞的激活。本实验发现，PD-L1在胃腺癌癌细胞和间质细胞中的表达均与CD163表达呈正相关，表明通过分析PD-L1表达与CD163表达之间的相关性可进一步预测患者预后，并对抗PD-1/PD-L1免疫卡控点抑制剂的应用提供潜在研究基础。本实验发现，PD-L1在胃腺癌间质细胞中表达越高，患者预后越好，并与肿瘤浸润深度及肿瘤分期呈负相关；胃腺癌癌细胞中PD-L1的表达与患者预后无关。既往研究发现，PD-L1高表达患者，生存期较短，预后较差[12-13]；相反，同样有研究表明PD-L1阳性患者预后较好[14]；对早期胃癌进行研究发现，在PD-L1高表达的病例中更易观察到血管和淋巴管的侵犯[15]；而最近的一项荟萃分析结果表明，在胃癌的治疗中，抗PD-1/PD-L1单克隆抗体被认为是一种具有前景的免疫疗法[11]。因此，PD-L1表达与患者预后的关系存在争议，PD-L1在胃癌组织中的表达与患者预后的关系尚需更多研究进行深入探究。

TAMs可分泌多种细胞因子，抑制效应T细胞的活性，促进肿瘤的进展，在实体肿瘤中，TAMs的表达高低可影响患者预后。本实验结果表明，CD163的表达与患者预后无关，但与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期呈正相关。然而，肿瘤组织中PD-L1和TAMs的关系仍未阐明，在对乳腺癌的研究中发现，乳腺癌细胞可分泌促使M1型TAMs向M2型TAMs转化的细胞因子，并且CD163+M2型TAMs数目越多，肿瘤分化越差，增殖更快[16]。在非小细胞肺癌中，M2型TAMs的浸润与淋巴结转移、病理分期及更差的无瘤生存期和总生存期相关[17]；另外，有研究发现TAMs在结直肠癌中可通过产生IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子激活NF-κB，从而分泌VEGF促进肿瘤血管生长和转移[9]。同时有研究表明，TAMs可通过JAK/STAT3和PI3K/ALK通路促进PD-L1的表达[18]。本实验发现，CD163的表达与PD-L1表达呈正相关，亦发现PD-L1高表达同时CD163低表达的患者预后最佳，而PD-L1低表达同时CD163高表达的患者预后最差，这些结果表明，联合评估PD-L1和CD163的表达可更好的评估患者的预后特征，为抗PD-1/PD-L1单克隆抗体的应用筛选合适的患者人群提供新思路，同时也为胃癌的免疫治疗提供了新的视角和方向。

采用免疫卡控点抑制剂的治疗方法如抗PD-1/PD-L1的单克隆抗体正在越来越多的癌种中使用，而TAMs通过表达PD-L1/2成为靶向免疫检查点治疗的重要组成部分，在一些细胞因子或缺氧条件的刺激下，巨噬细胞中的PD-L1/L2表达上调，促进肿瘤转移和进展[19]。也有研究表明，TAMs可以促进胃癌上皮-间质转化[20]。值得注意的是，TAMs具有明显的异质性，且可塑性较强[21]。有报道发现，通过抑制髓系生长因子受体CSF1R的信号通路，可以增加巨噬细胞提呈抗原和抗肿瘤的能力，同时联合PD-1或CTLA-4拮抗剂可更好的诱导肿瘤消退[22]。这些结果表明通过靶向TAMs的治疗策略可能会减少PD-L1在肿瘤组织中的表达，从而激活效应T细胞，进而增强抗PD-1/PD-L1阻断剂的效果。

综上，本实验结果表明，胃腺癌组织中CD163表达与PD-L1表达呈正相关，表明通过阻断TAMs的激活通路，同时联合免疫卡控点疗法如PD-L1单克隆抗体在胃癌的免疫治疗或许能起到更好的效果。