蒙古栎花芽分化、花器官发育及花粉离体萌发特性研究

王玉涛，郭雨竹，李佳宁，王澍涵，冀宗琪，陆秀君

（沈阳农业大学林学院，沈阳110161）

蒙古栎(Quer cus mongolicaFisch.ex Ledeb.)为壳斗科(Fagaceae)栎属(QuercusL.)树种，材质坚硬，耐磨损，耐腐蚀，是优良的用材树种，因树形优美，秋叶艳丽，也是北方重要的园景树或行道树。近年来，蒙古栎橡实利用也广泛受到人们重视，其含淀粉较多，可用来制作橡酒、酒精、淀粉、也可制作肥皂及其他工业用油[1]，还可提取生物燃料[2]。但是，蒙古栎种子年间结实量变化存在明显的大小年波动现象[3]，严重影响种实开发利用产业的发展。花芽分化是林木开花结实的关键阶段之一，其分化状况直接影响种实的产量和质量[4]，花粉作为植物遗传信息的重要载体[5]，其活力对于授粉和结实也有重要影响。蒙古栎雌雄同株，雄花在株间和同株不同年份间开花量差异显著，且蒙古栎雄花先于雌花开放，花粉的活力受到自身和外部环境影响较大。可见，掌握蒙古栎的花芽分化和花粉萌发的规律可能是蒙古栎橡实高产稳产的有效方法，也是蒙古栎新品种的选育的基础。

近些年，对于蒙古栎的研究多集中在林分的空间结构特征[6-8]、生态防护效益[9-10]、苗木繁育[11-12]及种群遗传多样性[13-15]等方面，蒙古栎花芽分化及花粉萌发能力尚不明晰。因此，本研究在观测蒙古栎芽的外部形态发育过程的同时，采用石蜡切片法研究蒙古栎花芽分化时期及其变化特征，并对蒙古栎花粉结构和离体萌发能力进行测定，分析蒙古栎生殖器官发育规律，明确花粉萌发特性，以期为蒙古栎杂交授粉及选育橡实高产稳产的蒙古栎品种提供重要的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料取自沈阳农业大学校园，蒙古栎平均树高8.4m，平均胸径31.0cm，丛植于草坪上，附近伴生有海棠、丁香等灌木。挑选生长健壮、长势一致、无病虫害的植株10株进行观察和采样。

1.2 芽分化内外形态的观察方法

选择向阳方向的当年生或者1年生枝条观察和采集蒙古栎芽，每次选取5株树，每株树选取5～8个顶芽和侧芽，于2019年5月下旬开始，至2020年4月中旬结束，每2周取样1次，3月中旬改为1周1次。采集的蒙古栎芽一部分立即进行固定，用于制作石蜡切片，观察花芽内部结构；另一部分用游标卡尺测量芽长宽等指标，并置于体式显微镜下观察拍照记录。

1.3 蒙古栎花粉的采集

蒙古栎在沈阳地区一般在4月末的一周为开花盛期，雄花开放一般略早于雌花。试验在4月18日～25日分3次取蒙古栎植株枝条进行水培，当雄花开始散粉，轻轻的抖动花序，收集花粉，放入-20℃冰箱中进行保存。

1.4 蒙古栎花粉形态的观察

将花粉轻轻抖动均匀散落在贴有导电胶带的铝板上，进行喷金镀膜后，在扫描电镜（Hitachi，TM3030）下测量其极轴、赤道轴的长度，重复30次，同时观察花粉表面花纹。

1.5 蒙古栎离体花粉萌发率的测定

采用添加不同浓度的蔗糖和硼酸液体培养基观察蒙古栎花粉萌发率。蔗糖浓度设为0，50，100，150，200g·L-1，硼酸浓度设为0，100，200，300，400mg·L-1进行5因素5水平的双因素试验，试验中每个浓度设置4个重复。在双凹玻片上，滴培养液，用毛刷将花粉粒撒在培养基上，将玻片放入培养皿内，在28℃恒温箱内培养24h，每个重复上共观测6个视野，每个视野下花粉粒大于50粒，记录每个视野花粉总数和花粉萌发的数量。花粉管伸长的长度大于花粉粒的直径则认为花粉萌发。

2 结果与分析

2.1 蒙古栎芽的外部形态

由图1可知，蒙古栎花期过后，5月下旬开始孕育新芽，此时枝条顶端和叶腋处可见红色凸点。7月初，蒙古栎芽从凸点明显发育成芽状，顶端红色，无鳞片横径和纵径都约1.0mm。进入7月下旬，蒙古栎芽生长发育速度变快。由图2可知，8月下旬，蒙古栎顶芽纵径平均为6.85mm，横径平均为3.67mm，侧芽纵径平均为6.67mm，横径平均为3.54mm，芽逐渐饱满，鳞片层数增加，鳞片顶端由红色逐渐变为浅黄色。9月下旬，芽棕褐色，鳞片5～6层，顶芽纵径平均为8.12mm，横径平均为3.70mm，侧芽纵径平均为8.08mm，横径平均为3.61mm。10月下旬蒙古栎进入休眠期，鳞片开始变得坚硬。10月下旬，顶芽纵径平均为9.26mm，横径平均为4.22mm，侧芽纵径平均为8.49mm，横径平均为3.63mm。直至翌年1月，芽的大小没有明显变化，鳞片层数继续增加，鳞片继续变硬。翌年1～3月，芽变的充实饱满，鳞片增加。3月下旬，随着气温的回升，芽膨大，鳞片层数增多且有松动，芽外被鳞片颜色从褐色变黄褐色，顶芽纵径平均为10.40mm，横径平均为4.85mm，侧芽纵径平均为8.85mm，横径平均为3.86mm，4月初开始有新叶吐出。

图1 蒙古栎顶芽的外部形态Figure 1 External morphology of Q.mongolica’s apical buds

图2 蒙古栎顶芽和侧芽纵径和横径变化图Figure 2 Variation of longitudinal and transverse diameter of apical bud and lateral bud of Q.mon golica

2.2 蒙古栎花芽的内部结构及花器官形态

为更准确地描述林木花芽分化的特征，一般会细分为不同时期，但不同学者对不同植物花芽分化时期的划分有所区别[4]。根据蒙古栎芽分化过程中顶端分生组织的形态变化，可将蒙古栎花芽分化分为5个时期：（1）未分化期。8月上旬，蒙古栎顶芽长径已经大于4mm。由图3A可知，芽内部还未见叶芽和花芽的分化。8月中，可见营养茎端（图3B），茎的顶端分生组织表面积增大，且生长锥伸长，茎端的生长点，表皮细胞大小相似、排列紧密。（2）分化初期。9月上中旬，蒙古栎花芽开始分化，顶端生长点变宽，呈现先端圆滑的圆形突起，体积较小，外表面光滑（图3C）。生长锥具有典型的顶端分生组织，分为里层和外层，外层是原套，细胞个体较小，排列整齐紧密，里层是原体，主要是由许多不规则的细胞构成，个体较大。由图3C可知，叶芽和花芽形态不同，叶芽基部较宽，长度大于宽度，而花芽顶部出现膨大呈光滑的半球形。（3）萼片分化期。进入花芽分化期后，花原基进一步增大变宽，表面变圆钝，体积变大，从花原基的两旁边缘处分化出2个突起，为萼片原基（图3C）。10月中旬，萼片原基经过平周和垂周分裂，萼片原基的长度和宽度增加，随后萼片原基进一步分化向内弯曲，整体上看形成弧形，并稍向上翘（图3D）。（4）雄花形成期。蒙古栎进入翌年3月开始雌雄花分化，由图3E可知，蒙古栎芽中花原基有多个，分布在芽鳞片基部。图3F为蒙古栎最上端花原基的分化图，图中可见萼片伸长，花原基变宽，表面平坦，在花原基的外侧形成两个突起，为蒙古栎雄蕊原基（图3F），进入雄蕊形成期。蒙古栎花芽为雌雄同株，从外部形态上看，雄花早于雌花开放，内部发育也是雄蕊早于雌蕊分化。（5）雌花形成期。3月29日，雄蕊原基膨大，雄蕊原基内侧雌蕊原基开始分化（图3G），在花原基中间逐渐开始出现微小的突起。由图3H可知，雌蕊原基逐渐增大分裂，显示为多个凸起。由图3F和图3G可知，蒙古栎花原基有雌雄花分化，但是靠近芽上部的发育成雌花，下部的发育成了雄花。从蒙古栎展叶前的芽纵向解剖图（图3I）也可见蒙古栎雄花序着生在芽的外侧，柔荑花絮，雄花发育比雌花略快。

图3 蒙古栎芽内部结构Figure 3 Internal structure of Q.mon golica’s bud

图4A和图4B为4月上旬蒙古栎去鳞片的芽实物图。由图4A可知，雄花序着生在芽的外侧，继续去除外侧的雄花、幼叶和绒毛状的组织后，可见芽上部有多个未发育完全的雌花序（图4B）。蒙古栎花叶同期，一般在4月中旬叶片展开时，即可见雄花序，雄花序着生在新枝下端，4月下旬新枝上端叶腋可见雌花序（图4C），雌花呈红色，多个雌花组成雌花序（图4D），雌花柱头成熟时，其柱头顶端为深红色，柱裂期柱头表面湿润，有利于花粉附着（图4E），授粉后柱头逐渐干枯（图4F）。柔荑雄花序由于多个雄花组成，雄花只见雄蕊，雄蕊由花药和花丝组成，花丝极短。花药由4个花粉囊组成，花粉囊的形状似蝴蝶状（图4G和图4I），花粉囊由里到外依次是绒毡层、中层、纤维层和表皮层（图4H），散粉后花粉囊干瘪。

图4 蒙古栎花器官特征Figure 4 Q.mongolica’s floral organ

2.3 蒙古栎花粉形态及离体萌发特性

2.3.1 蒙古栎花粉形态 蒙古栎花粉以单粒方式存在，形态为长椭圆形（图5A和图5B），赤道面观和极观面分别为长椭圆形和三裂圆形。由表1可知，蒙古栎花粉粒极轴长平均值为41.22μm，赤道轴长平均值为22.64μm，属于长球形中粒花粉。从极轴面上，可观察到它具有3条萌发沟，花粉粒上的萌发沟延伸到花粉的两极，沟脊之间距离两端窄中间宽。花粉外壁纹饰较粗，颗粒明显，在扫描电镜下看到聚颗粒状纹饰（图5C）。

图5 蒙古栎花粉微观结构Figure 5 Pollen microstructure of Q.mongolica

2.3.2 蒙古栎花粉离体萌发特性 由表1可知，蒙古栎花粉在清水培养基下萌发率非常低，只有2.99%，添加不同浓度蔗糖和硼酸可显著增加花粉的萌发率。培养基中添加蔗糖时，萌发率随着蔗糖浓度升高先增加后降低，蔗糖浓度100g·L-1时，萌发率最大，为22.86%，其次为蔗糖浓度50g·L-1时，萌发率为19.20%，此两个蔗糖浓度的花粉萌发率显著高于其浓度。培养基中只添加硼酸，萌发率也会显著增加。当硼酸浓度100g·L-1时，萌发率最大，为15.07%。培养基中同时添加蔗糖和硼酸时，萌发率仍然显著增加，但是各处理间差异显著。当蔗糖浓度为150g·L-1、硼酸200mg·L-1时，蒙古栎的花粉萌发最大，达到46.59%。蔗糖浓度为200g·L-1、硼酸300mg·L-1时，萌发率次高，为39.88%。

表1 蒙古栎花粉离体萌发率Table 1 Germination rate of Q.mon gol ica’s pollen in different treatment combinations

本试验发现，蔗糖浓度为150g·L-1、硼酸200mg·L-1的培养基上蒙古栎萌发效果最好，因此利用该培养基观察蒙古栎花粉萌发过程，结果表明，长椭圆形的蒙古栎花粉粒（图6A）接触到培养液后，花粉粒会迅速吸水膨胀，花粉粒从长椭圆形变成近球形（图6B）；当花粉粒在培养基上培养2h，有少量的花粉萌发，花粉管伸出花粉粒呈透明状（图6C）；当花粉粒在培养基上培养4h，花粉粒的萌芽的数量增加，萌发率可达到12.76%（图6D），花粉管长度平均达到40.89μm，有些花粉管长度可达花粉直径2～3倍；当花粉粒在培养基上培养8h时，花粉萌芽率可达到15.45%，此时花粉管长度是培养4h花粉管的2倍（图6E），随着培养时间的延长，蒙古栎花粉管还会不断伸长，培养到22～24h，萌发情况不再发生明显变化，此时花粉管的平均长度是培养4h的2.5倍，平均为102.26μm（图6F）。培养超过24h后，培养基易发生污染，影响观察效果。

图6 蒙古栎花粉萌发的过程Figure 6 Pollen germination process of Quercus mon gol ica

3 讨论与结论

蒙古栎新芽在5月下旬开始孕育，9月上中旬芽顶端生长点变宽，呈现先端圆滑的圆形突起，进入花芽分化初期。多数树种是在开花前一年夏季到秋季之间进行[4]，如葡萄（Vit i s vinifera）的花芽在头年夏季开始分化[16]、油橄榄(Olea euro paea)花在结实头年的9月下旬开始分化[17]，与蒙古栎花芽分化时期相似，而胡桃楸(J uglans mands hurica)[18]、山核 桃(Carya il l inoinensi s)[19]、桂花（Os manthus fragr ans）[20]和甜樱桃（Pr unus avium）[21]等，仅在开花前1～2个月进行花芽分化。花芽的分化时期因植物种类不同划分有所不同，如有研究者将苹果(Malus pumila)花芽分化过程划分为6个时期[22]，除了蒙古栎划分的5个时期外，增加花瓣原基分化期[21]。栎属植物雌雄花序都具有花被，但是蒙古栎雌雄花序缺少花被的具体描述[23]，在蒙古栎芽分化时可见萼片的分化，后期发育中也未观察到明显的花萼，可能是萼片发生退化，这还有待进一步研究。蒙古栎花芽是混合芽，芽鳞片内包裹数层绒毛状的组织，给制作切片和观察结构带来一定的困难，花芽分化过程中结构变化和芽诱导的关键因素等需有待进一步研究。另外，蒙古栎结实存在大小年现象，本研究对蒙古栎花发育过程外部形态和内部结构进行了研究，发现花芽内部发育与外部形态之间具有一定的时序性对应关系，可为判断蒙古栎发育进程，为合理采取栽培管理措施提供参考依据。

蒙古栎花粉在清水培养基上萌发率非常低，只有2.99%，分别加入蔗糖和硼酸会显著增加花粉粒萌发率。蔗糖是花粉管壁合成的主要营养物质，又是参与花粉代谢与跨膜运输的碳源[4]，蔗糖在培养过程中不断被消耗，培养基中所需要的蔗糖浓度随花粉所储存的营养物质发生变化。在蔗糖浓度为100g·L-1的培养基上蒙古栎花粉萌发率最大，继续增加蔗糖浓度，花粉萌发率显著下降，与小黑杨（Po pulus s i moni i×P.nigra）[24]、百合花（Lilium）[25]花粉萌发的试验规律一致。硼酸能增加糖的吸收、运转和代谢[4]，培养基中增加硼酸，蒙古栎花粉萌发率也表现出显著增加，但是蒙古栎花粉萌发率最大只有15.07%。同时加入蔗糖浓度和硼酸，蒙古栎的花粉萌发率增高。可见花粉离体萌发需要适量的蔗糖作为萌发营养物质和碳源，同时需要硼酸等物质促进营养物质的吸收、代谢，合成构成花粉管壁的果胶物质。

蒙古栎新芽在开花结束后当月即孕育。芽的分化受多因素影响，顶芽比侧芽发育充分，芽分化的各个时期也较为明显，这可能是蒙古栎枝条上端开花结果较多的主要原因之一。蒙古栎主要是依靠风媒传粉，同一个花芽中雄花略早于雌花发育，有利于蒙古栎异花授粉。蒙古栎花粉萌发率较高，单个雄花序花粉量较大，是蒙古栎传粉能力优势的体现。但是在试验中也发现，蒙古栎不同植株芽发育的量和发育程度有明显的差异，直接影响翌年的开花和结实，树体营养差异可能是造成开花结实周期的主要原因，如何利用栽培措施提高芽的发育，特别是提高芽中花芽的发育质量有待进一步研究。