女性生殖道微生物群与女性不孕症的研究进展

奚方修越，章翊，孙宁霞

随着基因第二代测序(NGS, next-generation sequencing)技术的兴起，通过对微生物16S rRNA基因的测序，深度分析微生物群成分及研究微生物群与人体生理功能、疾病病理的关联取得了新进展。定植于人体的微生物群能够帮助机体对抗病原体的入侵，促进免疫系统和代谢通路的成熟及合成多种必需的维生素等，而人类微生物群紊乱也可能导致某些疾病的发生发展，如炎症性肠病、肥胖和2型糖尿病等。阴道微生物群是目前研究最为广泛的女性生殖道微生物群，由种类丰富的厌氧菌和需氧菌构成。传统观点认为生理状态下女性上生殖道中没有微生物的定植，但现在这个观点被新的研究结果彻底推翻。研究表明，通过联合应用16S rRNA基因测序和微生物培养技术发现女性的阴道、子宫颈管、宫腔、输卵管以及腹水中均存在微生物定植，且女性生殖道各个解剖部位定植微生物群并不完全相同。女性生殖道微生物群紊乱与不孕症、辅助生殖结局等的相关性也取得了重要发现。

1 女性生殖道微生物群

2012年，人类微生物组计划(HMP, Human Microbiome Project)指出阴道微生物群占据人体总微生物群的9%，乳酸杆菌属(Lactobacillus)是其中最具代表性的细菌，其他代表性的细菌包括普氏菌属(Prevotella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、加德纳菌属(Gardnerella)、奇异菌属(Atopobium)、巨球型菌属(Megasphaera)、纤毛菌属(Sneathia)和厌氧球菌属(Anaerococcus)。女性下生殖道微生物群的构成不仅受年龄和性激素的影响，还与人种、基因、地理以及社会环境因素相关，卫生习惯、性行为、性伴侣以及避孕用品的使用情况也可能导致女性下生殖道微生物群构成的改变。

Ravel J等[1]对396名育龄期女性的阴道分泌物进行16S rRNA基因测序，将女性阴道微生物群落分为5种群落类型(CST, community state types)，其中CST-Ⅰ、CST-Ⅱ、CST-Ⅲ、CST-Ⅴ分别是由卷曲乳酸杆菌(Lactobacilluscrispatus)(26.2%)、格氏乳酸杆菌(Lactobacillusgasseri)(6.3%)、惰性乳酸杆菌(Lactobacillusiners)(34.1%)和詹氏乳酸杆菌(Lactobacillusjensenii)(5.3%)作为优势菌种，CST Ⅳ的优势菌群不是乳酸杆菌，而是专性厌氧菌，如奇异菌属、小类杆菌属(Dialister)、加德纳菌属、巨球型菌属、普氏菌属和不解糖嗜胨菌属(Peptoniphilus)，其中CST Ⅳ-A成分包括乳酸杆菌和专性厌氧菌，CST Ⅳ-B则是由奇异菌属、普氏菌属、纤毛菌属(Sneathia)、加德纳菌属等构成。Albert AY等[2]对310名女性的阴道样本测序发现阴道微生物CST Ⅳ还存在分别由加德纳菌属亚群A(CST Ⅳ-C)和加德纳菌属亚群C(CST Ⅳ-D)作为优势菌属的类型。这些女性阴道微生物群落是呈动态变化的，各种CST之间可以相互转变，但这些转变并不是同等概率出现的，如CST Ⅳ-B常转变为CST-Ⅲ，很少转变为CST-Ⅰ，CST-Ⅰ常转变为CST-Ⅲ或CST Ⅳ-A，同时在自然状态下群落转变的持续时间短暂，其中35%持续时间不超过1周[3]。

尽管子宫颈管直接与阴道环境接触，但在其中检测到的菌群与阴道中的并不完全相同，主要是乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)。而Winters AD等[4]对25名女性进行宫颈拭子16S rRNA基因测序，发现宫颈中最常见的微生物是不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、管道杆菌属(Cloacibacterium)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)。

子宫内膜在女性生殖功能中起着关键性作用。Mitchell CM等[5]分析对比58名女性子宫切除前阴道和子宫切除后离体子宫宫腔中的菌群构成，在95%的宫腔样本中发现细菌的定植，最常见的细菌属种是惰性乳酸杆菌，其次是普氏菌属和卷曲乳酸杆菌，同时发现宫腔中细菌菌群含量要明显小于阴道中的菌群含量。在育龄期女性宫腔积液的研究中，发现宫腔积液中含量最丰富的细菌同样为乳酸杆菌属，且宫腔积液中的微生物群结构不受女性性激素的调控[6]。但是Pelzer ES等[7]通过对子宫内膜搔刮组织进行焦磷酸测序，发现子宫内膜微生物群结构在月经周期不同阶段存在差异，分泌期普氏菌含量增加，而增殖期纤毛菌(Sneathiaspp.)和乳酸杆菌含量增加。关于乳酸杆菌属是否为子宫内膜微生物群中的“核心”菌属存在争议。Winters AD等[4]的研究认为子宫内膜的主要微生物与宫颈相似，为不动杆菌属、假单胞菌属、管道杆菌属和丛毛单胞菌科。

Pelzer ES等[8]应用微生物培养及NGS技术对16名女性输卵管样本进行分析，证实了女性输卵管存在微生物群定植，主要是葡萄球菌(Staphylococcusspp.)、肠球菌(Enterococcusspp.)和乳酸杆菌，其他常见的菌群包括假单胞菌、伯克霍尔德菌(Burkholderiaspp.)、丙酸杆菌(Propionibacteriumspp.)和普氏菌，其中右侧输卵管主要是葡萄球菌，左侧输卵管主要是乳酸杆菌、肠球菌和普氏菌，且绝经前女性和绝经后期女性输卵管定植的微生物群存在差异，表明性激素可能对女性上生殖道微生物群定植存在调控作用。卵巢组织中同样存在微生物。Pelzer ES等[9]对71名接受辅助生殖治疗的女性的取卵时所获取的卵泡液进行微生物培养，发现卵泡液中同样存在微生物定植，包括惰性乳酸杆菌、放线菌(Actinomycesspp.)、金色棒状杆菌(Corynebacteriumaurimucosum)、梭形杆菌(Fusobacteriumspp.)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)、消化链球菌(Peptostreptococcusspp.)、丙酸杆菌(Propionibacteriumspp.)、普氏菌、葡萄球菌和近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)，左侧卵巢卵泡中定植微生物生物量较右侧多。

但是胎盘中是否存在微生物群定植目前仍存在争议。2014年Aagaard K等[10]首先报道，在对320个胚胎组织应用16S rRNA基因测序和全基因组鸟枪(WGS, whole-genome shotgun)测序技术分析后，发现胎盘微生物群构成与口腔微生物群相似，主要是厚壁菌门(Firmicutes)、软壁菌门(Tenericutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)。但de Goffau MC等[11]在对537个胎盘样本进行分析后认为胎盘样本中的生物量非常小，不存在微生物组，发现的大部分细菌属于污染菌，很多细菌仅仅是在分娩过程中定植于胎盘，或是在宫腔感染后上行至胎盘定植的，尽管在5%的临产前胎盘样本中找到无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，但并未证实它和不同的妊娠结局相关。

2 女性生殖道微生物群与女性不孕症

生殖道微生物紊乱会对女性生殖健康产生影响，可导致生殖道内环境失衡和各种女性生殖疾病病理状态的形成，进而影响胚胎的形成、着床和发育。Babu G等[12]通过对比116名不孕症女性和84名健康女性的阴道拭子标本，发现健康女性阴道微生物群中优势菌属主要是乳酸杆菌属、微球菌属(Micrococcus)、肠球菌属(Enterococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，而不孕症女性阴道微生物中的优势微生物是假丝酵母菌属(Candida)、肠球菌属和大肠埃希氏菌，细菌性阴道病(bacterial vaginosis, BV)相关菌群含量升高，以乳酸杆菌属为优势微生物群的样本量少，且不孕症女性诊断出无症状性阴道炎比例(27.6%)高于健康女性(7.1%)。一项对比分析79名接受体外受精 (in vitro fertilization, IVF)技术治疗的不孕症女性和7名健康女性的阴道以及子宫内膜微生物群结构差异的研究，结果显示不孕症女性阴道及子宫内膜中非乳酸杆菌优势微生物群占比均较健康女性高[13]。这些研究结果表明女性生殖道微生物群的改变可能是女性不孕症的病因之一。

近年来不断有证据表明女性生殖道微生物也和辅助生殖结局存在关联性。Riganelli L等[14]的研究表明接受IVF-ET技术治疗并成功受孕的女性，阴道微生物中惰性乳酸杆菌含量明显升高，而治疗失败的女性阴道微生物中阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis)、费格森埃希菌(Escherichiafergusonii)和健齿链球菌(Streptococcusdentisani)含量增多。Moreno I等[6]发现子宫内膜中以非乳酸杆菌为优势微生物群的不孕症女性，接受IVF-ET技术治疗的胚胎着床率、持续妊娠率率和胎儿活产率要明显低于乳酸杆菌优势微生物群的不孕症女性。但子宫内膜微生物是否能够确实影响辅助生殖的结局仍然存在争议。Franasiak JM等[15]应用16S rRNA基因测序技术对33名接受单胚胎移植的女性的胚胎移植导管尖端样本进行分析，结果显示成功受孕的女性和胚胎移植失败的女性子宫内膜中的主要微生物均为乳酸杆菌属和黄杆菌属。除了阴道和宫腔之外，一项关于取卵时卵泡液中定植微生物群与IVF-ET结局的研究发现，低胚胎移植率与右侧卵泡的卵泡液中出现丙酸杆菌、链球菌相关，而高胚胎移植率与双侧卵泡卵泡液中出现乳酸杆菌相关，且不良妊娠结局与左侧卵泡液中出现放线菌、双歧杆菌、丙酸杆菌、链球菌以及右侧卵泡液中出现放线菌、双歧杆菌和中间链球菌(Streptococcusintermedius)相关，良性妊娠结局与左侧卵泡液出现乳酸杆菌相关[16]。

3 微生物治疗在女性不孕症上的应用

研究者试图将女性生殖道微生物作为女性不孕症治疗的新“靶点”。Chenoll E等[17]从阴道样本中分离出菌株鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus)BPL005，将其与定植了阴道阿托波菌(Atopobiumvaginae)、阴道加德纳菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)和无乳链球菌的原代子宫内膜上皮细胞模型共同培养，发现痤疮丙酸杆菌和无乳链球菌含量明显减少，这表明微生物制剂在生殖健康领域有应用潜能。一项纳入392名反复种植失败(repeated implantation failure, RIF)女性的研究发现，其中44.9%的女性子宫内膜微生物群为非乳酸杆菌属优势微生物群，最常见的微生物是阴道加德纳菌，然后将这44.9%的女性分为5组，分别应用口服益生菌药片Lebenin(粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、嗜酸乳酸杆菌和婴儿型双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)构成)+口服益生元Lf(牛奶来源的糖蛋白乳铁蛋白)、阴道及口服联合应用抗菌药物(甲硝唑)、Lebenin+Lf+甲硝唑、阴道益生菌栓剂inVag(格氏乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermentum)和植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)构成)、inVag+甲硝唑治疗，各组分别有29.5%、33.33%、33.33%、43.6%、78.6%的女性子宫内膜微生物群恢复为乳酸杆菌属优势微生物群，inVag+甲硝唑联合治疗组最高[18]。而Lev-Sagie A等[19]则对阴道微生物移植(vaginal microbiome transplantation, VMT)进行了探索性研究，将健康女性的阴道分泌物移植到5名难治性细菌性阴道病女性的阴道中，其中4名女性BV相关症状得到长期完全缓解，且阴道中优势微生物恢复为乳酸杆菌属，1名女性仅获得临床症状的部分缓解，这为女性生殖道微生物紊乱的后续研究带来了新的希望。

4 结论

随着近年来对于女性生殖道微生物群研究的深入，女性上生殖道已被证实并不是“无菌”环境，整个女性生殖道存在着连续的微生物群定植。与阴道不同，女性上生殖道样本获取需要通过侵入性操作，取材难度大，且女性上生殖道微生物生物量低，多样性高，在取材和检验时易受其他菌群污染，影响结果分析及判断，女性生殖道微生物研究仍存在许多障碍，尤其是生殖道微生物中的“核心菌种”和胎盘中是否存在微生物定植现在仍存在广泛争议。现在女性生殖道微生物的研究范围涵盖了女性生殖道微生物群结构和功能研究，也包括“疾病与微生物群紊乱”的研究，研究者正试图确定哪些微生物群或微生物群落类型的存在能够提示女性生殖道处于“微生物群紊乱”状态，明确这种紊乱状态与疾病的关联，并将它们作为疾病治疗的新“靶点”，给疾病治疗带来新的可能。虽然现有的研究仍不能完全证实女性生殖道微生物群与女性不孕症存在必然的关联，且这些临床研究存在治疗方案及微生物检测技术标准化不统一的问题，但越来越多的证据表明改善女性生殖道微生物群对女性生育结局存在积极的影响。尽管目前女性生殖道研究仍处于起始阶段，但相信随着女性生殖道微生物研究的深入，“微生物疗法”将为不孕症女性带来更多的可能。