miR-146a减轻心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)大鼠的心肌细胞凋亡

郑 新，于海波

(佳木斯大学附属第一医院 心血管内三科，黑龙江 佳木斯 154002)

缺血性心脏病是一种全球性、对人类健康危害极大的心脏疾病。治疗过程中血流急速再灌注导致心肌负荷过大在很大程度上损伤了心肌细胞，致使细胞凋亡数量大大增加造成组织损伤进行性加重，此过程被称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)[1]。研究显示，在该病患者的血液中检测发现心肌酶水平明显升高[2]。Toll样受体(TLR)4作为能够介导多种细胞因子活化的细胞受体有报道显示其在心肌组织灌注受损时呈现过表达，可能介导了MI/RI的炎性反应[3]。微小RNA(miRNA)是近些年发现的一种新的基因表达调节物，miR-146a定位于人类5号染色体，具有免疫调节作用[4]。然而目前关于miR-146a在MI/RI的作用效果及作用原理的相关研究未见报道。因此本实验通过对大鼠模拟MI/RI，探讨miR-146a对该病大鼠的血清心肌酶谱、TLR4及心肌细胞凋亡作用的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SPF级SD大鼠36只，雄性，体质量220～250 g，7～8周龄，实验室平均温度(22±2)℃，相对湿度60%，常规喂养(上海赛伦生物公司，动物实验伦理委员会批准，批准号20160071)。

1.1.2 试剂:乌拉坦(武汉卡布达公司)、一抗TLR4兔抗鼠抗体、TNF-α兔抗鼠抗体、NF-κB兔抗鼠抗体及二抗(武汉艾美捷公司)、TUNEL试剂盒(Roche公司)、PVDF膜(Millipore公司)；RT-qPCR试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)；cTnT检测试剂盒、CK-MB检测试剂盒(上海佰晔生物公司)和LDH检测试剂盒(合肥莱尔生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠分为假手术组(sham)、模型组(model)、miR-146a NC组(结扎后转染miR-146a-NC)、miR-146a agomir组(结扎后转染miR-146a-a agomir)，均9只。各组大鼠分为建模方法参考[5]，采用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，连接小动物呼吸机，呼吸器(60次/min)，潮气量为13～15 mL，分离皮肤，于第4肋骨处开胸，从左侧4肋间进入胸腔，用7-0滑线结扎冠状动脉左前降支30 min，然后解开结扎线恢复血管通畅，冠状动脉再灌注4 h后缝合胸腔，建立心肌缺血再灌注动物模型。假手术大鼠仅开胸后缝合。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色方法评估各组大鼠心肌梗死面积。

1.2.2 TTC 染色观察大鼠心肌梗死体积所占百分比：取大鼠心脏剔除周围组织置入甲醛溶液中固定，保存在-80 ℃的环境下，5 min后将厚度为2 mm额极向后冠状面储存于1%浓度的TTC溶液中。在无光环境下37 ℃孵育，将心肌组织翻动一次，5 min/次，成功染色后，正常心肌组织为红色，梗死组织为白色，用专业图像分析软件处理并分析图像，计算大鼠心肌梗死体积所占百分比。

1.2.3 RT-qPCR检测心肌组织中miR-146a、TLR4表达：取大鼠心肌组织，用Trizol进行总RNA的提取并测定总RNA浓度、纯度，反转录参照试剂盒说明书执行,将逆转后所得的cDNA通过Eppendorf MAS荧光定量 PCR分析系统进行检测。所有反应严格按照反应的条件进行扩增,内参采用β-actin，目的基因的相对表达用2-△△Ct表示(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 心肌酶谱活性的检测：多次采集眼眶全血6 mL，放置20 min(25 ℃)，2 000 r/min离心10 min，血清-70 ℃冻存。用比色法检测血清cTnT、CK-MB和LDH活性。

1.2.5 大鼠心肌组织形态学的观察：心肌组织切片石蜡包埋，5 μm切边，脱蜡10 min后利用95%乙醇水化，采用碱性苏木精进行染色15 min，PBS冲洗3次，蒸馏水清洗，再利用0.5伊红染色3 min，PBS透明，HE染色并在显微镜下观察心肌组织细胞病理状态。

1.2.6 TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡率：心肌组织进行石蜡切片，2 μm的5张，按照TUNEL试剂盒操作说明进行TUNEL染色处理，胞核黄染为凋亡细胞。采用400倍光学显微镜在每一张切片选取5个不重叠的视野进行观察并分别取凋亡细胞、细胞总数的均值。凋亡率(%)=凋亡细胞/总细胞数×100%。

1.2.7 Western blot测定心肌组织中TLR4蛋白的表达：取心肌组织100 mg，0.125%胰蛋白酶消化，离心取上清液。另取50 mg心肌组织提取核蛋白。Bradford法测蛋白浓度并将浓度调整为5 mg/L，取50 μL蛋白样品电泳，转膜，封闭，加入一抗1∶5 000(TLR4、TNF-α、NF-κB)后TTBS漂洗，间隔10 min,一共3次漂洗,最后加入二抗1∶1 000对溶液稀释,封闭1 h(25 ℃)。取出PVDF膜吐温Tris缓冲液每10 min清洗，共3次，DAB显色后照相。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TTC染色检测心肌梗死面积变化

假手术组、模型组、miR-146a-NC组及miR-146a agomir组心肌梗死面积分别为(2.56±0.50)%、(45.20±4.23)%、(43.05±3.69)%和(22.15±2.03)%，组间比较存在差异(P<0.05)。模型组与假手术组相比，心肌梗死区域(白色)面积增加(P<0.05)，与模型组相比，miR-146a agomir组心肌梗死区域(白色)面积降低(P<0.05)(图1)。

图1 4组心肌梗死面积变化Fig 1 Changes of myocardial infarction area in 4 groups

2.2 RT-qPCR检测心肌组织大鼠miR-146a、TLR4 mRNA表达

模型组与假手术组相比miR-146a mRNA表达降低(P<0.05)，与模型组相比，miR-146a agomir组miR-146a mRNA表达升高(P<0.05)，说明转染成功。模型组与假手术组相比，TLR4 mRNA表达升高(P<0.05)，与模型组相比，miR-146a agomir组TLR4 mRNA表达降低(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group图2 4组大鼠心肌组织中miR-146a、TLR4mRNA表达量Fig 2 Expression levels of miR-146a and TLR4 mRNA in myocardial tissue of rats in the 4 groups

2.3 比色法检测大鼠血清心肌酶谱活性

模型组与假手术组相比大鼠血清cTnT、CK-MB、LDH 活性增加(P<0.05)，与模型组相比，miR-146a agomir组上述指标均活性降低(P<0.05)(表2)。

表2 4组大鼠血清心肌酶谱活性比较Table 2 Comparison of myocardial enzyme activity in serum of 4

2.4 大鼠心肌组织形态学观察

假手术组心肌细胞分布较为整齐有规律、胞间距较小。模型组、miR-146a NC组心肌肌纤维断裂肿胀、间质充血明显、结构消失、细胞多处坏死界限不清，miR-146a agomir组与模型组、miR-146a NC组相比水肿减轻，上述病理均有一定改善(图3)。

图3 4组心肌组织形态学变化Fig 3 Morphological changes of myocardial tissue in 4 groups(×200)

2.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

模型组与假手术组相比心肌细胞凋亡数目增加(均P<0.05)，与模型组相比，miR-146a agomir组细胞凋亡数量明显减少(P<0.05)(图4)。

2.6 Western blot法检测TLR4、TNF-α、NF-κB蛋白表达

模型组与假手术组相比大鼠心肌组织中TLR4、TNF-α、NF-κB蛋白明显升高(均P<0.05)，miR-146a agomir组上述蛋白表达较miR-146a NC组、模型组明显降低(P<0.05)(图5)。

3 讨论

MI/RI是复杂的多因素多途径的综合性病理生理过程，发生于犬类心脏冠状动脉结扎模型中[6]。本文建立心肌缺血/再灌注动物模型后转染miR-146a-a agomir能够显著改善心肌组织病理损伤，降低心肌细胞凋亡，抑制心肌酶谱水平，作用机制通过抑制相关信号通路表达而实现。

*P<0.05 compared with sham group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group图4 4组大鼠心肌细胞凋亡情况Fig 4 Apoptosis of myocardial cells in 4 groups(×200,

*P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group图5 4组大鼠心肌组织蛋白表达情况Fig 5 Expression of protein in myocardial tissue of rats in 4

miRNA是一种能够通过DNA调控基因表达的保守型非编码短链RNA序列，其可以诱发的mRNA降解在细胞增殖、分化等功能中意义重大[7]。miRNA的特异性表达在心力衰竭、心肌细胞凋亡等病理进程中具有关键性作用[8]。miR-146a是具有免疫调控功能的mRNA。对24只I/R炎性肠损伤建模大鼠进行试验检测发现miR-146a在大鼠肝组织中呈现低表达并介导TLR4活化刺激肝组织炎性损伤[9]。然而目前尚无关于miR-146a在MI/RI中作用的研究报道，本文研究结果显示miR-146a过表达的miR-146a agomir组大鼠心肌细胞凋亡较模型组、miR-146a NC组明显减少。HE染色观察到miR-146a agomir组的细胞坏死、病灶范围等情况较模型组、miR-146a NC组有所改善，以上结果均说明过表达miR-146a在心肌细胞的凋亡中发挥抑制作用。

cTnT、CK-MB主要分布在心肌组织中，其表达与患者损伤严重程度成正比。LDH存在于骨骼肌、心肌中，其表达的提高也间接提示了心肌受损[10]。48例心肌梗死患者血清检测中发现miR-302b表达上调与心肌细胞损伤相关，可诱导患者心肌细胞坏死或凋亡，同时研究还证实了miR-302b的表达上调与cTnT、CK-MB、LDH的表达呈正相关，提示cTnT、CK-MB、LDH高表达可加重心肌梗死患者心肌细胞损伤程度[11]。学者研究发现鹿茸多肽能够通过抑制血清中心肌酶谱的表达改善MI/RI[12]。本文研究结果与之相似，推测miR-146a对大鼠MI/RI的保护作用与降低心肌酶谱水平相关。

TLR4源自TLRs家族，是一种存在于机体所有细胞系的炎性跨膜受体，能够识别配体产生促炎以及炎性趋化因子引发机体炎性反应，在感染性疾病研究中广受关注[13]。TNF-α、NF-κB是TLR4的下游因子，TLR4激活后能够刺激TNF-α产生炎性反应，促使正常细胞凋亡，使心肌损伤严重化，而NF-κB能够调控TLR4下游多种细胞因子的合成表达，其激活后可产生TNF-α形成恶性循环系统[14]。学者在研究中发现给MI/RI大鼠注射吴茱萸次碱能够减少MI/RI大鼠心肌细胞凋亡数量对大鼠心脏起到保护作用，并证实吴茱萸次碱对MI/RI大鼠的保护作用的发挥是通过截断TLR4信号通路阻止TLR4、NF-κB蛋白表达实现的[15]。结果显示TLR4拮抗剂干预的MI/RI小鼠心功能能得到改善，TLR4表达量显著降低，血清促炎因子浓度降低而抗炎因子指标上升。结果证实了TLR4表达下调后抑制炎性反应对小鼠MI/RI起保护作用。因此推测miR-146a对大鼠MI/RI的保护作用与降低TLR4表达相关。

综上所述，miR-146a在MI/RI大鼠心肌细胞中低表达发挥促细胞凋亡作用，其上调后可通过降低心肌酶谱水平及TLR4表达，减少心肌细胞凋亡进而保护大鼠MI/RI。