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lncRNA RAB11B-AS1上调miR-628-3p抑制人胃癌细胞系增殖和迁移

2021-12-08杨宁波贾晓东

基础医学与临床 2021年12期
关键词:荧光素酶存活率耐药性

杨宁波,贾晓东,寇 耀

(遂宁市中心医院 胃肠外科,四川 遂宁 629000)

胃癌是常见的消化道肿瘤之一,化学药物治疗(简称化疗)是胃癌的重要治疗方式之一,然而化疗耐药是导致化疗效果不佳或失败的重要原因,因此,提高癌细胞对化疗药物的敏感性对提高临床化疗疗效意义重大[1]。而深入研究肿瘤细胞的耐药分子机制可为提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性提供有效策略。lncRNA广泛地参与了肿瘤的发生、发展过程,且参与调控胃癌的增殖、转移和耐药发生等[2]。如lncRNA RAB11B-AS1在胃癌组织中高表达,可作为胃癌诊断和预后评估的潜在分子标志物[3]。lncRNA RAB11B-AS1在体外可增加乳腺癌细胞的迁移和侵袭,并促进肿瘤血管生成和乳腺癌远处转移[4]。然而lncRNA RAB11B-AS1对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及机制尚不清楚。研究显示,miRNA与胃癌增殖、侵袭、转移、预后及化疗耐药等密切相关[5]。提高miR-628-3p表达水平能抑制HGC-27细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1期及S期,且促进细胞凋亡[6]。而miR-628-3p对胃癌HGC-27细胞顺铂耐药性的影响尚不清楚。因此,本实验旨在研究lncRNA RAB11B-AS1是否通过调控miR-628-3p影响胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及顺铂耐药性。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃黏膜细胞系GES-1和胃癌细胞系HGC-27(ATCC公司);RPMI-1640培养基(上海浩然生物技术有限公司);顺铂(上海北诺生物科技有限公司);四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司);实时荧光定量PCR检测试剂盒(TaKaRa公司);RIPA蛋白裂解液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);Transwell小室、Matrigel(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 顺铂耐药胃癌细胞系的建立:HGC-27用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,取对数增殖期HGC-27细胞,依次用浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的顺铂培养存活细胞,每一浓度连续传代3次;将在0.4 mg/L浓度下存活的细胞命名为HGC-27/DDP。

1.2.2 细胞的转染与分组:取对数生长期HGC-27/DDP的细胞,将si-NC、si-RAB11B-AS1转染至HGC-27/DDP细胞中,分别记为si-NC组、si-RAB11B-AS1组;正常培养的HGC-27/DDP细胞作为对照组。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率:取分别用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L顺铂培养的HGC-27、HGC-27/DDP细胞,对照组细胞不作任何处理,按试剂盒说明操作,检测490 nm处吸光度值(A)。实验组与对照组A值的比值为细胞存活率;其他各组细胞存活率均按上述方法进行。

1.2.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RAB11B-AS1和miR-628-3p的表达水平:提取培养48 h细胞的总RNA,反转录合成cDNA,以GAPDH和U6为内参进行PCR,相对表达量用2-△△Ct法计算。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期:培养各组细胞48 h后收集细胞,并制备单细胞悬液,按试剂盒说明操作,上机检测激发波长488 nm处红色荧光,重复3次。用流式细胞仪和DNA细胞周期分析软件进行检测分析。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭:迁移实验:将无血清培养的200 μL细胞悬液加入到Transwell上室,下室加含血清培养液,培养24 h,然后用结晶紫染色,显微镜下拍照计数。侵袭实验:用Matrigel包被Transwell上室,其余同迁移实验。

1.2.7 蛋白质印迹(Western blot)检测Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达:提取细胞总蛋白,定量后进行SDS-PAGE,转膜,封闭,加入一抗和二抗孵育,加入化学发光试剂显影,定影,成像,检测蛋白条带吸光度,计算蛋白表达水平。

1.2.8 双荧光素酶报告实验检测RAB11B-AS1和miR-628-3p的靶向关系:使用PCR扩增包含miR-628-3p结合位点的RAB11B-AS1序列片段,并构建至荧光素酶表达载体中,获得RAB11B-AS1野生型载体(WT-RAB11B-AS1),将RAB11B-AS1序列AC UUACUAGA突变为AGCACAAGCC,获得RAB11B-AS1突变型载体(MUT-RAB11B-AS1),将其分别与miR-NC和miR-628-3p共转染至HGC-27/DDP细胞中,按说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 顺铂药物对HGC-27和HGC-27/DDP细胞存活率的影响

与对照组相比,0.2、0.4 mg/L顺铂处理后HGC-27细胞存活率显著降低(P<0.05),而0~0.4 mg/L顺铂处理后HGC-27/DDP细胞存活率无显著变化(表1)。表明胃癌顺铂耐药细胞建立成功。

表1 顺铂药物对HGC-27和HGC-27/DDP细胞存活率的影响Table 1 Effect of cisplatin drugs on the survival rate of HGC-27 and HGC-27DDP

2.2 RAB11B-AS1在HGC-27、HGC-27/DDP中的表达

与GES-1相比,胃癌细胞HGC-27和胃癌顺铂耐药细胞HGC-27/DDP中RAB11B-AS1表达水平显著升高(P<0.05),且HGC-27/DDP中RAB11B-AS1表达水平显著高于胃癌细胞HGC-27(P<0.05)(表2)。

表2 RAB11B-AS1在HGC-27、HGC-27/DDP细胞中的表达Table 2 Expression of RAB11B-AS1 in HGC-27 and

2.3 干扰RAB11B-AS1对HGC-27/DDP增殖、迁移、侵袭的影响

与对照组组和si-NC组相比,si-RAB11B-AS1组G0-G1期细胞所占比例显著升高,S期细胞所占比例显著降低(P<0.05),G2-M期细胞所占比例无变化;细胞存活率显著降低,迁移、侵袭细胞数显著降低(P<0.05)(表3)。

表3 干扰RAB11B-AS1对HGC-27/DDP增殖迁移侵袭的影响Table 3 Effect of RAB11B-AS1 interference on proliferation,migration and invasion of

2.4 干扰RAB11B-AS1对HGC-27/DDP细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin表达的影响

与对照组组和si-NC组相比,si-RAB11B-AS1组RAB11B-AS1表达水平显著降低,Ki67、N-cadherin表达水平显著降低,E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)(表4,图1)。

图1 Western blot检测Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达Fig 1 Western blot detection of Ki67,E-cadherin and N-cadherin protein expression

表4 干扰RAB11B-AS1对HGC-27/DDP细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin表达的影响Table 4 Effect of interference with RAB11B-AS1 on the expression of Ki67,E-cadherin and N-cadherin

2.5 RAB11B-AS1靶向调控miR-628-3p

RAB11B-AS1与miR-628-3p存在结合位点(图2)。miR-628-3p与WT-RAB11B-AS1转染的细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)(表5)。si-RAB11B-AS1组miR-628-3p表达水平为2.77±0.07,显著高于0.98±0.05(P<0.05)。

表5 双荧光素酶报告实验Table 5 Dual luciferase report

图2 RAB11B-AS1靶向miR-628-3pFig 2 RAB11B-AS1 targeted miR-628-3p

3 讨论

顺铂(cisplatin,DDP)是临床上应用广泛的化疗药物,其存在一定副作用,且其耐药性的产生使其疗效大大减弱[7]。胃癌细胞也易对顺铂产生耐药性,为研究胃癌细胞的顺铂耐药性的分子机制,本实验建立胃癌顺铂耐药细胞株HGC-27/DDP,在顺铂浓度大于0.2 mg/L时胃癌细胞HGC-27的存活率显著降低,而HGC-27/DDP细胞的存活率在顺铂浓度为0.4 mg/L时也无显著变化,说明HGC-27/DDP相比HGC-27细胞更耐药,耐药细胞株建立成功。

LncRNA参与调控胃癌的发生发展过程,且lncRNA还可影响胃癌的顺铂耐药性,如lncRNA UCA高表达会促进胃癌顺铂耐药[8-9]。LncRNA MEG3过表达可增加胃癌细胞对顺铂的敏感性[10]。本实验结果显示,RAB11B-AS1在胃癌细胞HGC-27和HGC-27/DDP中高表达,且HGC-27/DDP细胞中RAB11B-AS1表达水平高于HGC-27细胞;提示RAB11B-AS1或与胃癌细胞顺铂耐药性相关。本实验进一步通过干扰RAB11B-AS1,结果显示,G0/G1期细胞所占比例升高,S期细胞所占比例降低;细胞存活率降低,迁移、侵袭细胞数降低,Ki67、N-cadherin表达水平降低,E-cadherin表达水平升高。Ki67是一种细胞增殖核抗原,与细胞增殖息息相关,且研究还发现Ki67的表达与胃癌患者TNM分期,淋巴结转移相关[11]。E-cadherin、N-cadherin是上皮间质转化相关标志物,其表达水平与胃癌转移相关[12]。因此,本实验结果说明干扰RAB11B-AS1可抑制HGC-27/DDP细胞增殖、迁移、侵袭,且阻滞细胞周期,表明干扰RAB11B-AS1可提高HGC-27细胞对顺铂的敏感性。

本实验研究RAB11B-AS1对胃癌细胞的影响的进一步的可能作用机制,通过Starbase数据库预测其可能的靶miRNA,结果显示,RAB11B-AS1与miR-628-3p存在结合位点,且证实RAB11B-AS1可靶向调控miR-628-3p的表达。研究报道miR-628-3p可抑制HGC-27细胞增殖,促进细胞凋亡[6]。且miR-628-3p可促进肺癌细胞凋亡并抑制肺癌A549细胞迁移[13]。miR-628可抑制急性髓性白血病细胞增殖,并在体外诱导细胞周期停滞和凋亡[14]。提示,RAB11B-AS1对胃癌细胞的影响可能与miR-628-3p表达有关。

综上所述,抑制lncRNA RAB11B-AS1可能通过上调miR-628-3p抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并提高对顺铂的敏感性。

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