绿原酸抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞系HK-2纤维化因子表达

孙梦奎，李守林

(深圳市儿童医院 泌尿外科，广东 深圳 518038)

肾脏纤维化(renal fibrosis)包括肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质纤维化及细胞外基质异常分布等，是各类肾脏疾病、损伤进展到终末期时的主要病理改变之一。探索如何延缓甚至逆转肾脏纤维化从而更好的保护肾脏功能一直是研究的热点。绿原酸(chlorgenic acid，CGA)是由咖啡酸和奎宁酸聚合所形成的酯酸，是植物经有氧呼吸过程产生的苯丙素类化合物。有报道称其能够有效的缓解肺[1]、肝脏[2]等器官的纤维化。但是，其对肾脏纤维化是否有影响却暂无相关报道。肾脏纤维化的一个显著特点就是肾小管上皮细胞表达胶原纤维蛋白Ⅰ和Ⅲ增加。本研究拟探索CGA对人肾小管上皮HK-2细胞表达纤维化因子的影响及其潜在分子机制，为临床上治疗肾脏纤维化提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

人肾小管上皮细胞系HK-2(ATCC公司)；细胞培养基DMEM/F-12(Hyclone公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；绿原酸(Sigma-Aldrich公司)；重组人TGF-β1(PeproTech公司)；TRIzol试剂(Invitrogen公司)；RNA反转录试剂盒(TaKaRa公司)；目的基因上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；TLR4(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB)、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组:于含10%胎牛血清、青霉素 100 IU/mL和链霉素 100 IU/mL的DMEM/F-12培养基中培养人肾小管上皮HK-2细胞，培养条件为37 ℃，5% CO2细胞孵育箱中。CGA对HK-2细胞增殖的影响中，细胞分组为0、20、40、80 μg/mL的CGA分别处理细胞0、12、24、36、72 h，共20组。后续实验分组：对照组(磷酸盐缓冲液处理48 h)，TGF-β1组(5 ng/mL人重组TGF-β1处理48 h)。CGA组(20、40、80 μg/mL的CGA处理48 h)。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖:将处于对数增殖期的HK-2细胞混悬液以2×104个/mL接种于96孔板，每孔100 μL。静置24 h待细胞贴壁后，用100 μL的细胞培养基DMEM/F-12与10 μL的CCK-8试剂混匀，加入各孔之中并与细胞孵育1 h，在激发波长设为450 nm的酶标仪下测定各孔吸光度值(absorbance value，A)。

1.2.3 Real-time PCR检测mRNA表达:收集各组HK-2细胞，添加Trizol细胞裂解液1 mL提取总RAN。用分光光度计检测RNA吸光度值。波长在260 nm的吸光值/280 nm的吸光度值(A260/A280)位于1.8～2.1为合格样本，可用于后续实验。根据RNA反转录试剂盒说明书，用20 μL反应体系进行反转录，获得模板cDNA。采用20 μL反应体系以上述cDNA为模板进行扩增。其中cDNA为4 μL，上、下游引物分别为1 μL，SYBR混合物10 μL，超纯水4 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共计30个循环。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。上下游目的基因引物。Collagen Ⅰ上游序列5′-GCCAAGACGAAGACATCCCA-3′，下游序列5′-CACCATCATTTCCACGAGCA-3′；collagen Ⅲ上游序列5′-GAGCTGGCTACTTCTCGCTC-3′，下游序列5′-CCTTGACCATTAGGAGGGCG-3′；E-cadherin上游序列5′-GGGGTCTGTCATGGAAGGTG-3′，下游序列5′-CAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3′；α-SMA 上游序列5′-AAAGCAAGTCCTCCAGCGTT-3′，下游序列5′-TTAGTCCCGGGGATAGGCAA-3′；vimentin上游序列5′-CCGCACATTCGAGCAAAGAC-3′，下游序列5′-AAGCGCACCTTGTCGATGTA-3′；TGF-β1上游序列5′-ATGGTGGAAACCCACAACGA-3′,下游序列5′-ATGACACAGAGATCCGCAGTC-3′；snail上游序列5′-CGAGTGGTTCTTCTGCGCTA-3′,下游序列5′-GG GCTGCTGGAAGGTAAACT-3′；slug上游序列5′-AC GCCTCCAAAAAGCCAAAC-3′,下游序列5′-ACTC ACTCGCCCCAAAGATG-3′；GAPDH上游序列5′-TT GCAACCGGGAAGGAAATG-3′，下游序列5′-TGGA ATTTGCCATGGGTGGA-3′。

1.2.4 免疫荧光检测细胞胶原纤维的表达:将处于对数增殖期的HK-2细胞混悬液以2×104个/mL接种于6孔板爬片。4%多聚甲醛固定10 min，0.5%的Triton X-100透膜10 min，向玻片滴加山羊血清封闭30 min,然后滴加一抗孵育过夜。Collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的浓度均为1∶50。向玻片上滴加荧光二抗，湿盒中避光孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，红色荧光为阳性表达。每张切片随机取5个视野，采用Image Pro Plus 6.0图像处理分析软件计算高倍镜视野下荧光密度值。

1.2.5 Western blot检测目的蛋白表达:添加RIPA裂解HK-2细胞并提取总蛋白，使用BCA法进行蛋白定量。制备SDS/PAGE凝胶，各孔加入20 μL蛋白样。电泳分离蛋白，电转蛋白至硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入抗体TLR4(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)及GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，5 min/次。添加二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次。采用ECL化学发光和曝光显影。以GAPDH为内参。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度的绿原酸(CGA)对HK-2细胞增殖的影响

各浓度(0、20、40、80 μg/mL)绿原酸组细胞增殖之间无显著差异(表1)。

表1 CGA对HK-2细胞增殖的影响Table 1 Effect of chlorogenic acid on proliferation of HK-2 cells

2.2 CGA对TGF-β1诱导的HK-2细胞表达纤维化相关基因及蛋白的影响

与对照组相比，TGF-β1组collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin、TGF-β1、snail及slug 表达增加，而E-cadherin 表达降低(P<0.01)。与TGF-β1组相比，不同浓度的CGA能够降低collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin、TGF-β1、snail及slug表达，而增加E-cadherin 表达(P<0.01)(图1～2，表2～4)。

表2 CGA对HK-2 细胞collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin及α-SMA mRNA表达的影响Table 2 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,E-cadherin and α-SMA expression of HK-2 cells in mRNA level

表3 CGA对HK-2 细胞vimentin、TGF-β1、snail及slug mRNA表达的影响Table 3 Effect of chlorogenic acid on vimentin,TGF-β1,snail and slug mRNA expression of HK-2 cells in mRNA level

表4 CGA对HK-2 细胞collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表达的影响Table 4 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ and collagen Ⅲ expression of HK-2 cells

图1 CGA对HK-2细胞collagen Ⅰ表达的影响Fig 1 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ expression of HK-2 cells

图2 CGA对HK-2细胞collagen Ⅲ表达的影响Fig 2 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅲ expression of HK-2 cells

2.3 CGA对TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比，TGF-β1组TLR4、p-IκBα及p-NF-κB蛋白表达量增加(P<0.01)。与TGF-β1组相比，绿原酸(80 μg/mL)组的HK-2细胞TLR4、p-IκBα及p-NF-κB蛋白表达量明显降低(P<0.01)(图3，表5)。

表5 CGA对TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响Table 5 The effect of chlorogenic acid on expression of TLR4/NF-κB signal pathway related protein

图3 CGA对TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响Fig 3 Effect of chlorogenic acid on expression of TLR4/NF-κB signal pathway related protein

3 讨论

肾脏纤维化是所有慢性肾病或损伤如慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病等发展至终末期肾病的共同病理改变。截至目前，肾脏纤维化的机制尚未完全明了。寻找有效的抗肾脏纤维化手段是目前的研究热点。

CGA广泛分布于各类植物中，多项研究表明，CGA具有抗氧化[3]、抗肿瘤[4]的功能。除此之外，研究表明CGA能够有效的抑制肝脏纤维化，其具体机制与调节TGF-β1/Smad7信号通路[2]、抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路均有关系[5]。但是，CGA是否能够抑制肾小管纤维化却并无报道。

TGF-β1诱导HK-2细胞分泌纤维化因子是常用的肾脏纤维化细胞模型[6]。Collagen Ⅰ和collagen Ⅲ是肾间质重要的细胞基质成分，随着肾脏纤维化的进展，含量会显著增加[7]。细胞外基质出现异常积聚是肾脏纤维化特征性的表现之一，部分源自于肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞的合成和分泌[8]。本研究发现，TGF-β1预处理后的人肾小管上皮HK-2细胞collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表达增加，绿原酸处理HK-2细胞，能够降低collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表达，减少细胞外基质的产生，抑制肾脏纤维化。

研究表明，肾脏纤维化时肾小管细胞能够向间质细胞分化，转变为成纤维细胞，成为细胞外基质的一个重要来源[9]。上皮细胞向间质细胞转化表现为细胞黏附分子E-cadherin表达降低，α-SMA表达增加，细胞骨架发生变化，vimentin表达增加，snail、slug表达增加[10-11]。本研究中，CGA能够有效的抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞上皮间质化，从而抑制肾小管上皮纤维化。

有研究证实TLR4/NF-κB信号通路参与肾脏纤维化[12]。脐带来源的间充质干细胞的条件培养基能够抑制TLR4/NF-κB信号通路，从而保护大鼠部分输尿管梗阻导致的肾小管上皮的纤维化[13]。所以抑制TLR4/NF-κB信号通路，能够有效的保护肾小管上皮细胞，减少细胞纤维化。同时，大量研究表明，CGA能够有效的抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活[5]。本研究证实，CGA能有效的抑制TLR4/NF-κB信号通路。

综上所述，CGA能够有效的抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮HK-2细胞分泌纤维化因子，其分子机制与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活有关。