FK506联合低温机械灌注保护大鼠供肝

姜 骊，李建辉，俞 浩，李浩宇，谢海洋，周 琳，郑树森,*

(1.浙江大学医学院附属第一医院 实验动物中心，浙江 杭州 310003；2.卫健委多器官联合移植研究重点实验室，浙江 杭州 310003；3.浙江大学医学院附属第一医院 肝胆胰外科，浙江 杭州 310003)

肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效方法。在中国，终末期肝病患者大约有800万人。截至2018年末，中国器官分配与共享计算机系统(COTRS)中等候肝移植的患者尚有3 841名[1]。

心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death,DCD)供肝及扩大标准的边缘供肝应用可一定程度缓解供肝短缺，但也对器官修复提出了更高的要求[2]。机械灌注技术作为静态冷保存技术(static cold storage，SCS)的可能替代技术，越来越多研究结果证明其有较好的器官保护修复潜力[3]。同时机械灌注也成为了各种器官保护治疗药物的应用平台。通过向灌流液中加入药物、siRNA及干细胞等促进器官的保存修复已成为器官保护的一个重要研究方向[4]。FK506是临床常用的强力新型免疫抑制剂，在肝肾移植领域中得到广泛应用。同时可用于供肝移植前冲洗，减少肝脏缺血再灌注损伤的发生，促进肝脏恢复，但具体效果仍需探究。

因此本研究在前期机械灌注研究基础上[5]，依托自研小动物多器官灌注系统PU-100设备，将FK506作为灌流液组分加入HTK液(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution)中进行机械灌注，探索FK506联合低温机械灌注对供肝的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：24只8周龄雄性SPF级SD大鼠[杭州医学院SCXK(浙)2019-0002]。饲于浙江大学附属第一医院实验动物中心[SYXK(浙)2019-0012]。

1.1.2 主要试剂：HTK液(Dr.Franz Kohler化学有限公司)、FK506(中美华东制药有限公司)、戊巴比妥钠(成都贝斯特试剂有限公司)、肝素(信康医药化工有限公司)、磷酸盐缓冲液(PBS)(Sigma Aldrich 公司)，ALT、AST、LDH试剂(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：大鼠肝脏的获取按照本团队先前研究操作，具体方法见参考文献[6]。灌注平台基于小动物多器官灌注系统PU-100(中国 Lifeperfusor)进行搭建。供肝修整完毕后，将门静脉与小动物多器官灌注系统PU-100灌注平台连接，进行灌注。灌注期间参数设定如下：门静脉流量1.2 mL/min；温度4 ℃；灌注时间3 h。HTK组灌注液为150 mL HTK，FK506+HTK组为150 mL FK506(20 ng/mL)+ HTK液。大鼠肝脏经体外灌注后，进行肝移植，具体方法见参考文献[6]。灌注期间灌注压力流速监测，供肝体外机械灌注时，通过压力及流量传感器，实时监测灌流期间门静脉压力及流量，同时实时计算显示阻滞力。

1.2.2 肝功检测:实验组与对照组受体大鼠在移植后3 和24 h取血，肝功能ALT、AST及LDH均采用日本东京Hitachi 7600生化自动分析仪。

1.2.3 组织病理学观察:移植24 h后，麻醉，收集组织标本，10% 甲醛固定，HE染色，光镜下观察肝脏组织结构变化。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 移植后生存期

两组大鼠移植后1～2 h内麻醉苏醒翻身，一天内状态良好，无死亡，两组总体生存率100%，饮食饮水正常。

2.2 移植后大鼠肝功能(ALT、AST、LDH)

比较肝功能发现，移植后3和24 h时，FK506+HTK组ALT水平均低于HTK组(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with HTK group图1 移植后大鼠肝功能(ALT、AST、LDH)Fig 1 Liver function of rats after transplantation(ALT,AST,LDH)

2.3 移植后大鼠肝脏形态学观察

FK506+HTK组与HTK组移植后24 h肝脏细胞结构完整，无显著坏死；FK506+HTK组炎性因子浸润较HTK液组减少，表现出一定保护作用(图2)。

图2 移植后大鼠肝脏形态学Fig 2 Liver morphology of rats after transplantation(×200)

3 讨论

肝移植已成为终末期肝病唯一有效的治疗方法，机械灌注是一种有效的器官保存技术及器官保护和修复平台[7]。早期研究发现[8]，FK506作为器官移植术后抗排斥反应的一线免疫抑制剂，将肝脏大部切除术后的死亡率由100%下降至20%[9-10]。FK506冲洗肝脏在临床试验中遇到的困难，可能与冲洗肝脏的处理时间太短、浓度不合适等因素相关[11]。

本研究通过搭建新型大鼠肝脏灌注平台，建立一套具有温度、流速和压力可控的机械灌注系统。添加FK506的HTK液灌注离体大鼠肝脏，并进行肝移植。结果表明，灌流系统可有效稳定灌注大鼠肝脏，所有灌肝脏的移植受者大鼠均正常苏醒并存活，表明灌注系统可有效灌注肝脏。

为进步一步探究FK506对移植后大鼠移植物功能的影响，本研究发现FK506对移植后3和24 h时受体的肝功能具有显著的保护作用。因此本研究提示FK506体外灌注大鼠肝脏，有可能对移植后的肝功能具有一定的保护作用。Kupper细胞活化介导组织炎性损伤，引起肝功能的损害[12]。在移植后，两组肝脏均表现出完整组织结构，无显著细胞凋亡和坏死。相对于对照组，FK506组的中性细胞浸润显著减少，提示对术后肝脏炎性反应可有一定的抑制作用(图2)。

综上，本研究发现FK506可通过体外机械灌注技术对大鼠肝脏起到一定的保护作用。降低肝移植术后肝功能损伤，抑制炎性反应，保护肝脏。此外本研究为对其如何保护肝脏功能的机制未做探究。本团队将在接下来的研究中进行深入探究其潜在的可能机制。