达格列净降低心力衰竭大鼠心肌内质网应激并缓解左室重构

张志敏，苟丽沙，马丽群，任 可，路 军，魏 星，李慧杰，周圣华*

(新疆军区总医院 1.心内科；2.保健科，新疆 乌鲁木齐 830000)

心力衰竭(heart failure)是各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段，持续高血糖、缺血缺氧、血压升高等可单独或协同诱导心肌细胞肥大、损伤、凋亡，引起心室重构，最终导致心力衰竭。除经典改善心力衰竭、保护心肌细胞药物外，近年研制的新型降糖药物-达格列净(钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂)可明显改善糖尿病和非糖尿病心力衰竭患者的预后，具有显著的独立于降糖作用之外的心血管保护作用[1-2]。达格列净是中国心力衰竭指南中明确指出的具有心血管保护作用的降糖药[3]，但其独立的心血管保护机制仍不清楚。内质网应激是多种心血管疾病发生发展的共同分子机制之一，高糖、高血压、高同型半胱氨酸血症、缺血缺氧刺激等都可诱导心肌细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[4-6]，而上述刺激因素持续存在可激活ERS相关促凋亡蛋白如CHOP、caspase12等，调控细胞凋亡发生。因此有效抑制ERS对细胞起保护作用，达格列净是否有抑制心肌细胞ERS功效尚不可知。本研究通过主动脉缩窄(transverse aortic contriction,TAC)术建立心力衰竭大鼠模型，使用不同剂量达格列净干预治疗，观察其对心力衰竭大鼠心脏结构及功能的影响及探讨其潜在心肌保护分子机制，为达格列净临床应用提供新的理论依据。

1 材料及方法

1.1 动物及试剂

SPF级6～8周龄成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠20只，体质量180～200 g(新疆军区总医院实验动物中心，动物合格证编号：LJ-20206587)。达格列净片(诺华制药中国)；兔抗大鼠GRP78抗体及兔抗大鼠caspase12抗体和碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理:将大鼠分为对照组，腹主动脉缩窄(TAC)模型组,达格列净干预组(每日1次灌胃给予达格列净0.5和1.0 mg/kg)，每组5只，实验共12周。

1.2.2 大鼠血压值及心肌肥厚指数HWI及LVWI的测定:采用无创鼠尾血检测系统检测大鼠血压值，将大鼠放入无创鼠尾血压检测系统筒形固定器中，将脉压套置大鼠尾部近心端处，高敏脉搏换能器置于尾巴中上1/3处并固定，待脉搏稳定后测量血压。记录其心率，平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)=[舒张压+1/3(收缩压-舒张压)]。大鼠禁食不禁水24 h，称取大鼠体质量(body weight,BW)，使用戊巴比妥钠充分麻醉大鼠后开胸剪取心脏，剪去主动脉根部及脂肪组织，称取全心质量(heart weight,HW)。再剪去心房及右心室，保留室间隔及左心室，称取左心室质量(left ventricular weight,LVW)。计算HWI(HW/BW)和LVWI(LVW/BW)比值。

1.2.3 大鼠心脏功能及心肌组织HE染色形态学观察:采用小动物超声检测大鼠心脏功能，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠安静后，使用13 MHz M型超声探头连续测量5个心动周期。记录左心室收缩末期容积、左心室舒张末期容积、左心室收缩末期内径、左心室舒张末期内径，以计算EF及ES。将新鲜大鼠心肌组织置于多聚甲醛中固定后，经不同浓度乙醇梯度脱水，石蜡包埋，沿心脏纵轴连续切片，使用HE染色，置于光镜下观察心肌组织形态改变。

1.2.4 免疫组化检测大鼠心肌组织中GRP78及CHOP的表达:将大鼠心肌组织的石蜡切片经脱蜡→脱水→双氧水封闭→抗原修复→非特异性抗原封闭等步骤后，分别滴加1∶100比例稀释的兔抗大鼠GRP78及caspase 12一抗，4 ℃冰箱中孵育过夜。室温复温20 min后PBS洗涤，滴加1∶500稀释羊抗兔IgG于室温下孵育30 min，新鲜配置二甲基联苯胺显色，依次经苏木精复染→乙醇脱水→透明→中性树胶封片。于光镜下观察染色效果，并拍照记录。

1.2.5 Western blot检测大鼠心肌组织中GRP78及CHOP表达:取大鼠心肌组织，加适量组织裂解液，置于冰上研磨，静置30 min后取上清液，于4 ℃10 000 r/min离心10 min，留上清液。取少量上清液测蛋白浓度，余上清液中按比例加入上样缓冲液后于100 ℃沸水中煮5 min，置于-80 ℃低温冰箱保存。配制10%分离胶，取等量蛋白样品，使用凝胶恒压电泳分离蛋白并转至PVDF膜上。将PVDF膜置于含5%牛奶的TBST中，摇床摇动室温封闭60 min。依次滴加1∶1 000兔抗大鼠GRP78、caspase 12抗体，4 ℃冰箱振荡孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，1∶5 000 HRP-羊抗兔IgG室温振荡孵育1 h，TBST洗膜3，每次8 min,用ECL发光试剂于BIO-RAD成像系统发光成像，条带使用Image软件进行吸光度值分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠血压、心率及左室重构指标的变化

与对照组相比，模型组大鼠MAP、HWI及 LVWI明显升高(P<0.05)。与模型组相比，达格列净2组MAP明显降低(P<0.05)。与对照组相比，模型组显著升高(P<0.01)。与模型组相比，达格列净组HWI及 LVWI明显降低(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血压、心率及左心室血流动力学指标的比较Table 1 Comparison of blood pressure,heart rate and left ventricular hemodynamics in

2.2 各组大鼠心功能指标的变化

与对照组相比，模型组大鼠左心功能指标EF及FS值显著降低(P<0.01)；与模型组相比，达格列净1组EF及FS值明显升高(P<0.05)，达格列净2组EF及FS值显著升高(P<0.01)(图1)。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group图1 超声心动图检测各组大鼠LVEF及LVFS的变化Fig 1 Changes of LVEF and LVFS of rats in each group detected by echocardiography(×400)

2.3 HE染色显示各组大鼠心肌组织改变

模型组大鼠心肌纤维排除紊乱，细胞分支多，组织间较为疏松，部分肌纤维断裂；达格列净1组大鼠心肌纤维排列紊乱及组织疏松较模型组好转，少量肌纤维断裂，细胞形态不规则；达格列净2组大鼠心肌纤维排列整齐，组织较为致密，细胞形态规则，未见分支(图2)。

图2 各组大鼠心肌组织Masson染色图片Fig 2 Masson staining picture of myocardial tissue of rats in each group(×400)

2.4 免疫组化检测大鼠心肌组织GRP78、caspase 12蛋白表达变化

对照组大鼠心肌组织GRP78及caspase 12蛋白表达呈弱阳性，可见少量棕黄色颗粒分布于胞质；模型组大鼠心肌组织可见大量GRP78及caspase 12蛋白表达呈强阳性，可见大量棕黄色颗粒分布于胞质；达格列净1组大鼠心肌组织GRP78及caspase 12蛋白表达呈阳性，可见较多棕黄色颗粒分布于胞质；达格列净2组大鼠心肌组织GRP78及caspase 12蛋白表达呈弱阳性，可见少量棕黄色颗粒分布于胞质(图3)。

2.5 Western blot检测大鼠心肌组织GRP78、caspase 12蛋白表达水平变化

与对照组相比，模型组大鼠心肌组织GRP78及caspase 12蛋白水平表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，达格列净1组大鼠心肌组织GRP78及caspase 12蛋白表达明显降低(P<0.05)，达格列净2组大鼠心肌组织GRP78及caspase 12蛋白表达显著降低(P<0.01)(图4)。

3 讨论

心力衰竭的发生导致患者逐渐丧失劳动力，给家庭及社会带来沉重负担，但其发病机制复杂尚不完全明确，因此发现及研制新型抗心力衰竭药物以改善心脏结构及功能显得尤为重要。达格列净为新型降糖药物[7]，多项大型临床研究显示[8-9]，达格列净可显著降低主要心血管不良事件、因心血管原因死亡和心力衰竭住院风险，但其独立的抗心力衰竭作用尚不明确。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group图3 免疫组化检测各组大鼠心肌组织GRP78及caspase 12 表达水平Fig 3 Expression levels of GRP78 and caspase 12 in myocardium of rats in each group were detected

本研究采用TAC术建立心衰大鼠模型，以观察达格列净对不伴糖尿病心力衰竭大鼠心脏结构及功能的影响。研究结果显示，术后12周，大鼠血压、心率、HWI及LVWI较对照组显著升高，EF及ES水平较对照组显著降低，心肌细胞排列紊乱、细胞分支多，组织间较为疏松，部分肌纤维断裂。使用不同剂量达格列净自TAC术即干预治疗至第12周末，与模型组相比，达格列净组大鼠血压、心率未见明显变化，HWI及LVWI明显降低，EF、FS水平明显升高，HE染色见心肌细胞排列紊乱、组织疏松情况等明显改善，表明达格列净可抑制后负荷增加所致心肌重构，改善心脏结构及功能，对心肌细胞有效保护，但其潜在作用分子机制需进一步研究。

心力衰竭发生发展过程中多种分子机制激活已被证实[10-12]。心肌细胞ERS激活是贯穿心力衰竭病理生理发展过程的经典分子机制之一。使用TAC术建立心力衰竭小鼠模型，模型组小鼠心肌组织ERS相关信号通路激活[13]，心肌细胞应激启动蛋白GRP78表达显著升高，促凋亡蛋白caspase12表达显著升高，表明持续后负荷过度激活心肌细胞ERS，诱导促凋亡，这与既往研究结果一致[14]。使用达格列净干预后，大鼠心肌细胞GRP78及caspase12蛋白表达较模型组明显降低，表明达格列净降低心肌细胞ERS起始激活蛋白GRP78表达，从TAC术后早期即对ERS激活有抑制作用，从而减少促凋亡蛋白的表达。以上结果均提示抑制ERS可能是达格列净保护心肌细胞，改善心肌结构和功能，延缓心力衰竭进展的分子机制之一。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group图4 Western blot检测各组大鼠心肌组织中GRP78、CHOP蛋白表达的变化Fig 4 Changes of GRP78 and CHOP protein expressions in myocardial tissue of rats in each group detected by Western n=6)

综上所述，达格列净可改善TAC术后心力衰竭大鼠左室重构，改善心脏结构及功能，达格列净干预可抑制后负荷增加诱导的心肌细胞ERS激活，对心肌细胞起保护作用，可能是其缓解左室重构及改善心力衰竭的分子机制之一，本研究为达格列净具有心血管保护作用提供了新的理论依据。